鬼筆環(huán)肽-細胞骨架染色原理及實驗操作流程
細胞骨架是網狀纖維結構，是高度動態(tài)的，不同時期有不同的形態(tài)。它主要是由微絲，微管和中間絲所組成的。微絲主要是肌動蛋白組成的，肌動蛋白分成肌動蛋白單體（G-actin）和纖維狀蛋白單體（F-actin）。微絲的組裝就是G-actin 變成F-actin的過程。
圖1.細胞骨架結構（包含微絲，微管和中間絲）。圖片來源：《醫(yī)學細胞生物學：第七章 細胞骨架與細胞的運動》
鬼筆環(huán)肽是一種雙環(huán)七肽，最早發(fā)現的環(huán)狀肽之一，是從鬼筆鵝膏（Amanita phalloides）中分離出來的。通過結合和穩(wěn)定纖維狀肌動蛋白（F-actin）發(fā)揮功能，并有效防止肌動蛋白纖維解聚。由于其與F-肌動蛋白的緊密和選擇性結合，從而顯示微絲骨架在細胞中的分布，因此含鬼筆環(huán)肽的熒光標記已廣泛用于生物顯微技術中。
圖2.鬼筆環(huán)肽Phalloidin 的結構
值得注意的是，未經修飾的鬼筆環(huán)肽無法穿越細胞膜，這使其難以直接應用于針對活細胞的實驗。FITC和Rhodamin等熒光物質標記的鬼筆環(huán)肽可特異的與真核細胞的F-actin結合，從而顯示微絲骨架在細胞中的分布。
翌圣生物鬼筆環(huán)肽產品種類很多，主要是標記的熒光基團的不同，激發(fā)出的熒光顏色不同，對于選擇需要機器滿足激發(fā)和發(fā)射波長要求不同，用于區(qū)分共染時其他熒光染料的熒光顏色。
0.1mg鬼筆環(huán)肽溶于1ml無水甲醇（也可用DMSO或無水乙醇溶解）配成貯存液，可在-20度避光的條件下長期保存，工作液的濃度為5ug/ml，由貯存液加PBS稀釋20倍即可。
PBS清洗細胞2次，每次10分鐘；3.7%-4%的甲醛或多聚甲醛固定20分鐘，PBS清洗細胞2次；加入5ug/ml的FITC-鬼筆環(huán)肽室溫染色30-60分鐘，夏季時間可以短一些，PBS清洗細胞2次；DAPI或hoechst33258染細胞核10分鐘，PBS清洗細胞2次；吸去多余水分，加熒光封片液（中性或偏堿性緩沖液加等量甘油），蓋上蓋玻片，熒光或共聚焦顯微鏡下觀察。
引文出處：Zhu Z , Jiang S , Liu Y , et al. Micro or nano: Evaluation of biosafety and biopotency of magnesium metal organic framework-74 with different particle sizes[J]. Nano Research, 2020, 13(2):511-526.
產品介紹：染色使用的產品為FITC標記鬼筆環(huán)肽，染色為綠色熒光。圖片為通過MTT法和FITC標記鬼筆環(huán)肽以及DAPI染色確定Mg-MOF74對BMSCs的安全劑量，確保后續(xù)實驗在安全劑量的范圍內進行。
引文出處：Fan Z, Xiao L, Lu G, Ding Z, Lu Q. Water-insoluble amorphous silk fibroin scaffolds from aqueous solutions. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2020;108(3):798-808. doi:10.1002/jbm.b.34434
產品介紹：染色使用的產品為羅丹明標記鬼筆環(huán)肽，染色為紅色熒光。圖片為羅丹明標記鬼筆環(huán)肽染色以及DAPI染核，在共聚焦顯微鏡下觀察不同再生絲素蛋白支架上骨髓間充質干細胞向內皮細胞分化的情況。
總結：熒光和生物素化的鬼筆環(huán)肽衍生物，與肌動蛋白抗體相比具有明顯優(yōu)勢。鬼筆環(huán)肽偶聯物的結合不會隨物種（包括動植物）的肌動蛋白變化而發(fā)生明顯改變。此外，他們的非特異性染色可忽略不計。因此染色區(qū)和未染色區(qū)之間的對比度很高。
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親和力高：Kd= 20 nM；
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特異性強：選擇性結合于絲狀肌動蛋白F-actin，而不會與單體肌動蛋白G-actin結合；
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優(yōu)于抗體染色：鬼筆環(huán)肽無物種限制，且?guī)缀醪淮嬖诜翘禺愋匀旧?，染色區(qū)和非染色區(qū)域對比性極其明顯；
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靈敏度高：納摩爾濃度（nM）染色即可滿足實驗要求；
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兼容性好，肌動蛋白活力不受影響：鬼筆環(huán)肽衍生物很小，直徑約12-15Å，分子量＜2000 Da，標記后的肌動蛋白許多生理特性都得以維持；
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適用范圍廣：無物種差異性；同樣適用于甲醛固定和打孔處理后的組織樣本。
Q1：鬼筆環(huán)肽染色可以在活細胞中進行嗎？
A：鬼筆環(huán)肽的染色需要對樣品進行固定和透化，幫助鬼筆環(huán)肽和F-actin的結合，得到更好的染色效果。
Q2：我的細胞樣品轉染了帶有GFP的質粒，我應該選擇哪一款鬼筆環(huán)肽？
A：可以選擇TRITC（橙色），iFluorTM 555（橘色）或是iFluorTM 647（遠紅）標記的鬼筆環(huán)肽。
A：染色貼壁細胞只需要染色工作液能夠完全覆蓋細胞即可。
Q4：幾種不同的鬼筆環(huán)肽的區(qū)別是什么，如何選擇？
A：是熒光基團的不同，激發(fā)出的熒光顏色不同，用于區(qū)分共染時其他熒光染料的熒光顏色，對于選擇需要機器滿足激發(fā)和發(fā)射波長要求。
Q5：鬼筆環(huán)肽染色存在種屬區(qū)分嗎？
