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      TRITC Phalloidin 羅丹明標記鬼筆環(huán)肽
       
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      產(chǎn)品說明書
                  
      FAQ
                  
      COA
                  
      已發(fā)表文獻
                  
       
      

      鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）是一種來源于毒蕈類鬼筆鵝膏（Amanita phalloides）的環(huán)狀七肽毒素，以高親和力（Kd= 20 nM） 選擇性結(jié)合于絲狀肌動蛋白 F-actin，而不會與單體肌動蛋白 G-actin 結(jié)合，通常用來標記組織切片，細胞培養(yǎng)物或無細胞體 系中的 F-actin，從而對 F-actin 進行定性和定量分析。另外，鬼筆環(huán)肽衍生物也以相近的親和力結(jié)合于大小纖維，無論是動 植物來源的肌肉細胞或非肌肉細胞，按照每一個肌動蛋白亞基約與一個鬼筆環(huán)肽分子的計量比結(jié)合。且非特異性結(jié)合幾乎可 忽略，染色區(qū)域和非染色區(qū)域辨識度非常明顯。因此，鬼筆環(huán)肽衍生物特別適合替代肌動蛋白（Actin）抗體進行相關(guān)研究。 另外鬼筆環(huán)肽衍生物很小，直徑約 12-15Å，分子量＜2000 Daltons，未標記肌動蛋白（Actin）的許多生理特性都得以維持， 比如，同肌動蛋白結(jié)合蛋白如肌球蛋白，原肌球蛋白，DNase I 等仍能發(fā)生反應(yīng)；鬼筆環(huán)肽標記的纖維絲仍可穿透固相肌球 蛋白基質(zhì)；以及甘油抽提的肌纖維標記后仍可收縮等。
      


      鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）的結(jié)合阻止絲狀肌動蛋白（微絲）的解離，穩(wěn)定微絲結(jié)構(gòu)，從而破壞微絲的聚合-去聚合的動態(tài) 平衡。此特性使得肌動蛋白聚合發(fā)生的臨界濃度（CC）降至＜1 µg/mL，因此，可用作一種聚合促進劑。此外，鬼筆環(huán)肽還 可抑制 F-actin 的 ATP 水解活性。
      


      本品為 TRITC（四甲基異硫氰酸羅丹明）標記的鬼筆環(huán)肽，染色反應(yīng)特異性強，對比性高，具有比 Actin 抗體更好的染 色效果，適合用作 F-actin 的定性和定量檢測。另外，經(jīng)本品結(jié)合后的 F-actin 仍能維持 actin 自身具有的許多生物學(xué)特性。 且本品的結(jié)合沒有物種差異性，適用性廣泛。
      


      我司分別提供凍干粉形式（貨號：40734ES80）和儲存液形式（貨號：40734ES75，濃度為 20 µM）的 TRITC 標記鬼筆 環(huán)肽，用戶根據(jù)自身需求選擇。建議使用濃度為 80~200 nM。
      


       
      


      產(chǎn)品性質(zhì)
      


      
	
		
      
			
			
      分子式（Molecular Formula）
      
			      		
			
			
      C60H70N12O13S2
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      分子量（Molecular Weight）
      
			      		
			
			
      1231.4
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      最大激發(fā)/發(fā)射波長（Ex/Em）
      
			      		
			
			
      540～546/565～575 nm
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      多肽序列（Sequence）
      
			      		
			
			
      TRITC-bicyclic(Ala-DThr-Cys-cis-4-hydroxy-Pro-Ala-2-mercapto-Trp-4-hydroxy-5-amino-L eu)(S-3 to 6)
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      外觀（Appearance）
      
			      		
			
			
      紫色粉末（凍干粉）
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      溶解性（Solubility）
      
			      		
			
			
      溶于 DMSO、DMF、甲醇或者乙腈水溶液（20%）
      
			      		
		
      
	      

      


       
      


      運輸與保存方法
      


      冰袋運輸。-20℃避光干燥保存， 1年有效。
      


       
      


      注意事項
      


      1） 鬼筆環(huán)肽具有毒性，需小心操作（對人的半數(shù)致死劑量 LD50 約 2 mg/kg）。
      


      2） 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
      


      3） 本產(chǎn)品僅作科研用途！
      


       
      

      


      需要自備材料
      


      1） （可選）甲醇
      


      2） 1×PBS 緩沖液, pH 7.4, 細胞培養(yǎng)級別（貨號：41403ES76）
      


      3） 固定液 4%多聚甲醛（溶于 PBS 緩沖液）（貨號：60536ES60）
      


      4） 丙酮或透化液 0.5% Triton X-100（溶于 PBS 緩沖液）
      


      5） Fluoromount-GTM   水溶性封片劑（不含 DAPI）（貨號：36307ES08），DAPI（貨號：40727ES10）
      


      6） （可選）DAPI Fluoromount-GTM  水溶性封片劑（含 DAPI）（貨號：36308ES11）
      


      7） （可選）BSA，標準級別（貨號：36101ES25）
      


      8） 載玻片和蓋玻片
      


      9） 蓋玻片周圍密封液（如透明指甲油）
      


      10）組裝有 TRITC 激發(fā)/發(fā)射濾片，以及 DAPI 激發(fā)/發(fā)射濾片的熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡。
      


       
      


      操作步驟
      


      1.工作液準備
      


      1）對于 TRITC 標記鬼筆環(huán)肽（貨號：40734ES75，300 T）
      


      本品以溶于甲醇的 20 µM 儲存液形式提供，總量為 300 µL。按照 100 nM 的工作液濃度來換算，可制備總量為 60 mL 的工 作液。建議收到產(chǎn)品后，根據(jù)單次使用量，對母液進行小量分裝，-20℃避光凍存，一年穩(wěn)定。
      


      開始實驗前，使用 1×PBS 緩沖液稀釋儲存液到需要的工作濃度。推薦工作濃度為：80~200 nM。工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。
      


      2）對于 TRITC 標記鬼筆環(huán)肽（貨號：40734ES80，1 mg）
      


      本品以凍干粉形式提供，分子量為 1231.4，總量為 1 mg?？上扔眉状蓟蛘?DMSO 充分溶解配制成 20~100 µM 的儲存液。 如，加入 8.1208 mL 甲醇到 1 mg 鬼筆環(huán)肽即得到 100 µM 等量的儲存液，根據(jù)單次使用量，進行小量分裝，-20℃避光凍 存，一年穩(wěn)定。
      


      開始實驗前，使用 1×PBS 緩沖液稀釋儲存液到需要的工作濃度。推薦工作濃度為：80~200  nM。工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。
      


       
      


      2.染色步驟
      


      1）細胞爬片生長 24 h，使其密度達到 50%匯合度。
      


      2）吸掉培養(yǎng)液，37℃預(yù)熱的 1×PBS（pH 7.4）清洗細胞 2 次。
      


      3）使用溶于 PBS 的 4%甲醛溶液進行細胞固定，室溫固定 10 min。
      


      【注】避免固定劑中含有甲醇成分，因為甲醇在固定過程中可能破壞肌動蛋白。
      


      4）室溫條件下，用 PBS 清洗細胞 2~3 次，每次 10 min。
      


      5）室溫條件下，用丙酮（≤-20℃）脫水或者用 0.5% Triton X-100 溶液透化處理 5 min。
      


      6）室溫條件下，用 PBS 清洗細胞 2~3 次，每次 10 min。
      


      7）取 200 µL 配制好的 TRITC 標記鬼筆環(huán)肽工作液，覆蓋住蓋玻片上的細胞，室溫避光孵育 30 min（通常情況下，4℃~37℃ 孵育皆可）。
      


      【注】為了降低背景，可于 TRITC 標記的鬼筆環(huán)肽工作液內(nèi)加入 1% BSA；另外，孵育過程中為了避免溶液揮發(fā)，可 將蓋玻片轉(zhuǎn)移到一個密封的容器內(nèi)。
      


      8）用 PBS 清洗蓋玻片 3 次，每次 5 min。
      


      9）使用 200 µL DAPI 溶液（濃度：100 nM）對細胞核進行復(fù)染，約 30 s。
      


      10）用 PBS 清洗蓋玻片，然后倒置在已經(jīng)滴有一滴 Fluoromount-GTM 水溶性封片劑的載玻片上。使用紙巾輕輕檫掉多余封 片劑，然后用指甲油永久封片。此法制備的標本玻片可置于 4℃避光保存，通常 6 個月內(nèi)可繼續(xù)做 F-actin 染色分析。
      


      【注】也可以直接使用含有 DAPI 的抗熒光淬滅封片劑（貨號：36308ES11）合并步驟 9）10），簡化步驟。
      


      11）熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下進行熒光觀察，選擇 TRITC 激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=545/570 nm）和 DAPI 激發(fā)/發(fā)射濾 片（Ex/Em=364/454 nm）。
      


      HB221130
      

         
       
       
       
       
       
       
       
      400-6111-883