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      末端修飾T4 PNK，NGS建庫必備酶！
       
      

      下一代測(cè)序技術(shù)(Next-generation Sequencing, NGS)由于可以同時(shí)測(cè)定幾十萬乃至數(shù)百萬條核酸分子序列的顯著優(yōu)勢(shì)，在分子生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著舉足輕重的作用，越來越多的被應(yīng)用到生物醫(yī)學(xué)的研究領(lǐng)域中。T4多聚核苷酸激酶(T4 Polynucleotide Kinase，T4 PNK)作為NGS文庫構(gòu)建的關(guān)鍵酶之一，發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，接下來小翌將圍繞T4 PNK的作用方式、應(yīng)用場(chǎng)景等方面進(jìn)行介紹。
      


      

       
      

      

      


      

      圖1. 二代測(cè)序在臨床醫(yī)學(xué)中應(yīng)用[1]
      


       
      

      


      

      

      

      

      

      T4 PNK是什么
      

      

      

      

      

      


      

      T4 PNK是一種多聚核苷酸5'羥基激酶，同時(shí)具有激酶活性和磷酸酯酶活性，一般主要用來催化ATP的γ位磷酸基團(tuán)向單鏈或雙鏈DNA、RNA、寡核苷酸的5'羥基轉(zhuǎn)移，即5'末端磷酸化。
      

      


      

      

      


      

      圖2. T4 PNK作用方式
      


       
      

      


      

      

      

      

      

      T4 PNK應(yīng)用于DNA建庫
      

      

      

      

      

      


      

      T4 PNK廣泛應(yīng)用于NGS文庫構(gòu)建中，這里針對(duì)性的對(duì)如何在DNA建庫應(yīng)用進(jìn)行介紹。文庫構(gòu)建實(shí)質(zhì)上是將片段化后的DNA兩端加上通用接頭序列，通過PCR擴(kuò)增獲取足夠多能夠上機(jī)測(cè)序的文庫核酸分子。在DNA文庫構(gòu)建過程中，TA克隆連接接頭建庫是目前商業(yè)技術(shù)中最常用的技術(shù)手段，主要建庫流程如下：
      

      


      

      

      


      

      圖3. DNA建庫流程
      


      DNA片段化：目前市場(chǎng)中測(cè)序儀的測(cè)序長(zhǎng)度受限，因此需要使用機(jī)械/酶切打斷的方法將大片段基因組DNA進(jìn)行片段化。
      


      

       
      

      


      末修加A：打斷后的DNA會(huì)產(chǎn)生黏性末端以及平末端，T4 DNA聚合酶可將黏性末端轉(zhuǎn)為需要的平末端，T4 PNK可磷酸化DNA的5'末端，為下一步連接接頭做準(zhǔn)備。
      


      

       
      

      


      接頭連接：T4 DNA連接酶可將帶有“T”黏性末端的接頭和帶“A”黏性末端的DNA片段連接起來形成一個(gè)完整的雙鏈。
      


      

       
      

      


      PCR富集：通過PCR反應(yīng)獲取到足夠多帶完整接頭的DNA序列，上機(jī)完成對(duì)樣本核酸序列的測(cè)序。
      


      

       
      

      


      此外，T4 PNK還可應(yīng)用于RNA建庫、探針合成等技術(shù)當(dāng)中，其作用原理類似，都是利用其5'羥基激酶活性，這里就不展開介紹了。
      


      

       
      

      


      翌圣致力于NGS酶原料的開發(fā)，該T4 PNK具有純度高、核酸酶殘留極低的特點(diǎn)，產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中均經(jīng)過嚴(yán)格質(zhì)檢，確保能在文庫構(gòu)建中發(fā)揮優(yōu)異的性能。
      


       
      

      


      

      

      

      

      

      性能展示
      

      

      

      

      

      


      

      

      

      

      

      高純度
      

      

      

      

      

      


      

      

      


      

      

      圖4. SDS-PAGE跑膠結(jié)果：該圖為T4 PNK的純度檢測(cè)結(jié)果，其純度＞95%。
      

      

      


      

      

      

      

      

      無切口酶殘留
      

      

      

      

      

      


      

       
      

      


      

      

      圖5. 切口酶殘留結(jié)果：跑膠結(jié)果顯示三批次T4 PNK與陰性對(duì)照（C）一致，顯示無切口酶殘留。
      

      

      


      

      

      

      

      

      無核酸外切酶殘留
      

      

      

      

      

      


      

      

      


      

      

      圖6. 核酸外切酶殘留結(jié)果：跑膠結(jié)果顯示三批次T4 PNK與陰性對(duì)照（C）一致，顯示無核酸外切酶殘留。
      


       
      

      

      


      

      

      

      

      

      產(chǎn)品訂購
      

      

      

      

      

      


      

      
	
		
      
			
			
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      高效率T4 PNK
      
			      		
			
			
      T4 Polynucleotide kinase(10 U/μL) 
      

			
      T4多聚核苷酸激酶(10 U/μL)
      
			      		
			
			
      12902ES
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      高濃度高效率T4 PNK
      
			      		
			
			
      T4多聚核苷酸激酶
      

			
      T4 Polynucleotide kinase (25 U/μL)
      
			      		
			
			
      14501ES
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      超低背景菌殘留
      

			
      T4 DNA聚合酶
      
			      		
			
			
      UCF.ME® T4 DNA Polymerase (3 U/μL) 
      

			
      T4 DNA聚合酶(3 U/μL)
      
			      		
			
			
      14457ES
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      高效率連接酶
      
			      		
			
			
      Hieff® Quick T4 DNA Ligase
      
			      		
			
			
      10301ES
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      DNA純化/分選磁珠
      
			      		
			
			
      Hieff NGS® DNA Selection Beads
      
			      		
			
			
      12601ES
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      文庫定量試劑盒
      
			      		
			
			
      dsDNA HS Assay Kit
      
			      		
			
			
      12640ES
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      DNA建庫試劑盒
      
			      		
			
			
      Hieff NGS® Ultima Pro DNA Library Prep Kit 
      

			
      全能型DNA建庫試劑盒
      
			      		
			
			
      12197ES
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      Hieff NGS® OnePot Pro DNA Library Prep Kit 
      

			
      for Illumina®
      
			      		
			
			
      12205ES
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      RNA建庫試劑盒
      
			      		
			
			
      Hieff NGS® Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit 雙模
      

			
      式RNA建庫試劑盒(兼容Illumina和MGI)
      
			      		
			
			
      12308ES
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      Hieff NGS®UltimaDual-mode mRNA Library Prep Kit 兼
      

			
      容Illumina和MGI雙平臺(tái)以及雙模式mRNA 建庫試劑盒
      
			      		
			
			
      12309ES
      
			      		
		
      
	      

      

      


       
      


      

      

      

      

      

      參考文獻(xiàn)
      

      

      

      

      

      


      

      1. Consortium OPATHY, Gabaldón T. Recent trends in molecular diagnostics of yeast infections: from PCR to NGS. FEMS Microbiol Rev. 2019 Sep 1;43(5):517-547.
      


      2. Wang LK, Lima CD, Shuman S. Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme. EMBO J. 2002 Jul 15;21(14):3873-80.
      


      3. Head SR, Komori HK, LaMere SA, Whisenant T, Van Nieuwerburgh F, Salomon DR, Ordoukhanian P. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. Biotechniques. 2014 Feb 1;56(2):61-4, 66, 68, passim.
      

      

       
       
       
       
       
       
       
      400-6111-883