漲知識，對于PCR你真的知道么？
PCR作為分子生物學最基礎的研究方法之一。20世紀80年代凱利·穆利斯發(fā)明第一代PCR技術以來，“變性、退火、延伸”三部曲從未停歇。歷經(jīng)三十多年的演變，PCR技術已衍生出眾多變體。小翌總結了一代PCR的一些常見類型，助力您的科學研究。
常規(guī)PCR
常規(guī)PCR一般是由Taq DNA聚合酶介導的PCR反應，操作較為簡便，產(chǎn)物帶有A尾。通過瓊脂糖凝膠電泳對終產(chǎn)物進行定性和半定量分析。兼容樣本范圍廣，但保真性低，主要應用于常規(guī)重組質粒驗證和基因型鑒定等方面。
常規(guī)PCR產(chǎn)品
產(chǎn)品名稱：2×Hieff® Robust PCR Master Mix (With Dye)
產(chǎn)品特點：
1）延伸速度快（15-30s/kb），極限速度達5s/kb。
2）模板適用性更廣泛，靶基因GC耐受范圍35-70%。
圖1. 以小鼠基因組為模板，分別擴增1-4kb的片段
高保真PCR
高保真PCR一般是由保真性較高的DNA聚合酶介導的PCR反應。第一代高保真DNA聚合酶是從棲熱原始菌Pyrococcus furiosus中獲得的具有校正功能的pfu酶，與常規(guī)Taq酶相比多了一種3’-5’的核酸外切酶活性（Proofreading活性），保真性大大提高且擴增的產(chǎn)物通常為平末端。目前主要有2類產(chǎn)品：一類是混合型的高保真酶，將帶有Proofreading活性的酶與普通Taq酶混合用于提高擴增效率；另一類是單一型的高保真酶，保真性更高。
翌圣Hieff Canace® Gold高保真DNA聚合酶基于Pfu，經(jīng)基因工程改造而成。酶溶液中添加了獨特的反應增強因子、熱啟動因子和延伸因子，極大提高了擴增的成功率，特異性和延伸速度。對于高保真PCR應用而言，具有高保真性、高成功率、高特異性的Hieff Canace® Gold高保真DNA聚合酶是理想選擇。
高保真PCR產(chǎn)品
產(chǎn)品名稱：Hieff Canace® Gold PCR Master Mix
產(chǎn)品特點：
1）保真性高，是Taq酶的52倍，pfu酶的6倍。
2）超高特異性。
3）高靈敏：可擴增低至1 pg模板。
圖2. 5種品牌的高保真DNA聚合酶擴增2 kb，4 kb的小鼠gDNA。Y：Hieff Canace® Gold高保真DNA聚合酶；A-E：其他品牌的高保真DNA聚合酶。
熱啟動PCR
熱啟動PCR，也稱Hotstart PCR。指通過一定條件將DNA聚合酶與其他PCR反應物隔絕，使其低溫條件下無活性，高溫加熱后釋放酶活，進而避免出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物的PCR反應。熱啟動PCR的關鍵是熱啟動型的DNA聚合酶，一般通過抗體、配體或化學修飾等來封閉酶活性中心，不同的熱啟動修飾方法原理上有所區(qū)別，各有優(yōu)劣勢（見下表）。通常應用于復雜模板、低拷貝基因擴增，也是IVD試劑的核心原料。
|
化學修飾 |
配體修飾 |
抗體修飾 |
|
|
原理 |
低溫下，化學小分子和DNA聚合酶活性中心結合，酶無活性；溫度升高至變性溫度，兩者脫離，酶活性中心暴露，此時，聚合酶發(fā)生聚合反應。 |
核酸適配體通過非共價鍵作用與聚合酶結合，進而抑制聚合酶在非許可溫度下的聚合反應。 |
高溫變性前，抗Taq抗體與Taq酶結合，抑制聚合酶活性。溫度升高至變性溫度，抗Taq抗體變性失活，聚合酶發(fā)生聚合反應。 |
|
優(yōu)點 |
酶活性維持更加穩(wěn)定且無任何外源DNA污染，性價比較高。 |
酶激活時間短，保證酶活。 |
酶激活時間短，保證酶活，親和力強，靈敏度高。 |
|
缺點 |
酶激活時間較長，可能會影響酶的活性，導致 PCR 產(chǎn)物的產(chǎn)量降低。 |
核酸配體是一種可逆抑制劑，不如化學修飾法穩(wěn)定，特異性不夠強。 |
抗體修飾是一種動態(tài)平衡，不如化學修飾法穩(wěn)定，價格更貴。 |
熱啟動PCR產(chǎn)品
產(chǎn)品名稱：Hieff UNICON® HotStart Taq DNA Polymerase (抗體法熱啟動Taq酶)
產(chǎn)品特點：抗體法修飾，親和力強，靈敏度高，特異性好。
直擴PCR
翌圣直擴PCR系列產(chǎn)品運用獨特的裂解體系，快速裂解樣品，裂解液可直接作為模板，搭配試劑盒中的具有超強抑制物耐受性的Taq DNA聚合酶進行基因的高效擴增。
圖3.組織直擴系列流程圖
小鼠直擴PCR產(chǎn)品
產(chǎn)品名稱：Mouse Tissue Direct PCR Kit (With Dye) 小鼠組織直接PCR試劑盒
產(chǎn)品特點：
1）樣本需要量少：5mg鼠組織或1-5mm鼠尾。
2）模板制備更方便：無需研磨，無需精提純化gDNA。
3）優(yōu)化的PCR體系：具有更高的特異性、更強的 PCR 反應抑制物耐受性。
圖4.適合不同類型的小鼠粗提組織
多重PCR
多重PCR，也稱復合PCR。反應原理、反應過程與常規(guī)PCR無異，需要在同一個PCR反應體系中，使用多對引物對多個基因同時進行擴增。理論上只要PCR擴增的條件合適，引物對的數(shù)量可以不限，但實際由于各種條件的限制，實際能夠擴增的產(chǎn)物有限。多重PCR反應體系的組成和PCR循環(huán)的條件需經(jīng)過優(yōu)化以確保同時擴增多個片段。具有高效性、系統(tǒng)性、經(jīng)濟簡便性，難點是反應體系各組分的平衡。主要用于多種病原微生物的同時檢測或鑒定某些病原微生物、某些遺傳病及癌基因的分型鑒定。
圖5.多重PCR原理圖
多重PCR產(chǎn)品
產(chǎn)品名稱：Hieff® Multiplex PCR Kit
產(chǎn)品特點：
1）擴增子大小：適合50bp-1.5kb的擴增子。
2）均一性好：靶點偏好性極低。
3）特異性強：最大程度抑制非特異性擴增；
4）靈敏度高：可擴增低至1ng模板；
5）擴增重數(shù)：可達20-1000重。
圖6. 以人gDNA模板，進行10重PCR，可檢測低至1ng的模板
巢式PCR
巢式PCR是指利用兩對引物進行兩輪PCR擴增的反應。首先使用目的片段外圍的引物對模板進行擴增，然后使用內部的巢式引物同時將第一輪PCR擴增產(chǎn)物作為第二輪擴增的模板。第二次PCR擴增得到的目的片斷短于第一次擴增。翌圣GMyc-PCR 支原體檢測試劑盒基于支原體16S-23S rRNA序列保守區(qū)域利用巢式PCR法原理可精確檢測到常見的支原體污染。主要應用于病毒檢測、測序分析、低表達基因檢測等。
巢式PCR產(chǎn)品
產(chǎn)品名稱：GMyc-PCR Mycoplasma Test Kit GMyc-PCR支原體檢測試劑盒
產(chǎn)品特點：檢測多種支原體類型，檢測限低至單拷貝。
圖7. 巢式PCR擴增含不同濃度支原體樣品。
降落PCR
降落PCR，又稱Touch-down PCR。通過設置PCR程序中的退火溫度，一般開始時高于預設的Tm值，隨著反應的進行，退火溫度逐漸降低到Tm值，并最終低于該溫度進行PCR反應。通過反應程序中退火溫度的設置，極大程度上降低了引物與模板的非特異性結合。主要用于PCR反應程序的優(yōu)化，提高產(chǎn)物特異性。
常見的PCR類型介紹就到這里了。當然，除了上述介紹的PCR形式，還有錨定PCR、原位PCR等不同的PCR類型，如感興趣可自行查閱或留言哦！
相關產(chǎn)品促銷活動
