產(chǎn)品簡介

 

本試劑盒可直接快速地對小鼠組織（如鼠尾、鼠耳、鼠趾、肌肉等）樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具有極強(qiáng)的樣本兼容性。本試劑盒配備了強(qiáng)力的裂解緩沖液，可以快速裂解樣品，釋放基因組DNA。裂解液可以直接加入到PCR反應(yīng)體系中，無需精提純化，操作方便。此外，本試劑盒對樣品投入量要求低，5 mg小鼠組織或1-5 mm鼠尾即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

本試劑盒提供的2× Mouse Direct PCR Mix為2倍濃度的熱啟動(dòng)PCR反應(yīng)液，包含了用于PCR擴(kuò)增除模板和引物外的所有組分，大大簡化操作過程，降低污染幾率。且含有示蹤染料，PCR產(chǎn)物可直接電泳。

該試劑盒可用于轉(zhuǎn)基因鑒定、小鼠基因分型等。

 

組分信息

 

組分編號(hào)	組分名稱	10185ES50	10185ES70	儲(chǔ)存條件
10185-A	Buffer ML	1×5 mL	20×1 mL	2-8℃
10185-B	Buffer MT	0.6 mL	1.25×2 mL	-25~-15℃
10185-C	2× Mouse Direct PCR Mix	500 μL	1×2 mL	-25~-15℃

a) Buffer ML為裂解緩沖液，包含強(qiáng)力蛋白變性劑，請戴手套操作。

b) Buffer MT為終止緩沖液，用于終止Buffer ML的裂解功能。

c) 2× Mouse Direct PCR Mix：包含熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl₂、反應(yīng)緩沖液、PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑、優(yōu)化劑、穩(wěn)定劑和電泳指示染料等。

 

儲(chǔ)存條件

 

1. 試劑10185-A【Buffer ML】，2-8℃保存。如長時(shí)間未使用，請分裝凍存，避免交叉污染。

2. 試劑10185-B【Buffer MT】，-25~-15℃保存，避免反復(fù)凍融。

3. 試劑10185-C【2× Mouse Direct PCR Mix】，-25~-15℃保存，避免反復(fù)凍融。

試劑盒有效期1年。

 

使用說明

 

樣品基因組DNA釋放

1. 剪取5-10 mg動(dòng)物組織或1-5 mm鼠尾，置于1.5 mL離心管中；
2. 在上述離心管中加入90 μL Buffer ML，輕輕渦旋使得樣品完全被裂解液浸潤，短暫離心；
3. 在恒溫孵育儀中設(shè)置95℃孵育15 min；
4. 加入10 μL Buffer MT，輕彈混勻，終止裂解;
5. 選做步驟：12,000 rpm離心2 min；
6. 將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管，4℃或-20℃保存或直接取上清用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。

*組織應(yīng)盡量剪碎，以便裂解反應(yīng)更順利進(jìn)行。

**95℃孵育，一般15 min即可滿足多數(shù)PCR需求。若需要的DNA量較大或樣品較難裂解，可將時(shí)間延長至30 min。組織塊不需完全裂解，殘余的部分在后續(xù)離心步驟中可被除去。

PCR反應(yīng)鑒定——PCR反應(yīng)體系

組分	體積（μL）	終濃度
2× Mouse Direct PCR Mix	10	1×
Forward Primer (10 μM)	0.5	0.2-0.4 μM
Reverse Primer (10 μM)	0.5	0.2-0.4 μM
裂解產(chǎn)物（DNA模板）	1	-
無菌超純水	To 20	-

表1 PCR反應(yīng)體系

【注】：各組分使用前應(yīng)充分混勻。

a）模板使用量：建議按1-10%總體系量取用模板，20 μL體系建議采用1 μL上清液作為模板；

b）引物終濃度：0.2-0.4 μM可以得到較好結(jié)果。反應(yīng)性能較差時(shí)，可在0.1-0.5 μM范圍內(nèi)調(diào)整引物濃度；

c）反應(yīng)體系：推薦使用20 μL，也可根據(jù)使用習(xí)慣調(diào)整體系體積大??；

d）體系配制：配制好PCR反應(yīng)體系，置于渦旋儀上渦旋混勻，瞬時(shí)離心將反應(yīng)液集于管底。

PCR反應(yīng)鑒定——PCR反應(yīng)程序

循環(huán)步驟	溫度	時(shí)間	循環(huán)數(shù)
預(yù)變性	94℃	5 min	1
變性	94℃	10 sec	35***
退火*	60℃	20 sec
延伸**	72℃	30 sec/kb
終延伸	72℃	5 min	1

表2 PCR反應(yīng)程序

*退火溫度：請參考引物的理論Tm值，退火溫度可設(shè)置低于引物理論值2-5℃，或通過梯度PCR確定最佳溫度。

**延伸時(shí)間：請按30 sec/kb設(shè)定。

***擴(kuò)增循環(huán)數(shù)：35個(gè)循環(huán)已可以擴(kuò)增足量產(chǎn)物。

電泳上樣：取3-5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物上樣即可。

對照反應(yīng)：在PCR結(jié)果分析時(shí)，不管是陽性結(jié)果或陰性結(jié)果，如果沒有對照反應(yīng)，都不能確定結(jié)果是否可靠。為了便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，建議在進(jìn)行PCR時(shí)，設(shè)置陽性和陰性PCR對照反應(yīng)以便于排除假陽性或假陰性的干擾。

 

注意事項(xiàng)

 

1. 為了避免樣本間交叉污染，每次取樣后都需要將取樣器材的刃口或與樣本直接接觸的部位浸入2%次氯酸鈉溶液中，反復(fù)洗刷數(shù)次進(jìn)行清洗，然后用干凈的紙巾擦干殘余液體后再進(jìn)行使用。為了試驗(yàn)方便，也可準(zhǔn)備多個(gè)取樣器材，在使用完后進(jìn)行統(tǒng)一清洗，確保每一單獨(dú)樣本均使用的是無污染的取樣器材。
2. 建議使用新鮮采取的動(dòng)物組織，若為長期冷凍組織，應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融，否則會(huì)導(dǎo)致模板的降解，影響PCR效率。
3. 建議擴(kuò)增片段長度1 kb以內(nèi)，以便擴(kuò)增效率最佳。
4. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
5. 本產(chǎn)品僅作科研用途！

 

常見問題與解決方法

 

常見問題	可能原因	解決方法
陽性對照、待測樣本均無條帶。	PCR反應(yīng)體系或反應(yīng)條件不合適。	使用梯度PCR摸索PCR最佳反應(yīng)條件。
	PCR試劑保存不當(dāng)失去活性。	2×PCR Mix應(yīng)保存于-25~-15℃，使用時(shí)避免反復(fù)凍融。若使用頻繁，可在2-8℃短時(shí)間存放。
	引物設(shè)計(jì)問題。	嘗試重新設(shè)計(jì)引物進(jìn)行檢查。
陽性對照有目的條帶，待測樣本無條帶或條帶弱。	不當(dāng)儲(chǔ)存或長期儲(chǔ)存引起試劑活性喪失。	使用新鮮的試劑。
	加入組織裂解液過量。	增大反應(yīng)體系，或減少裂解液的用量。
	樣本裂解混合液保存不當(dāng)或保存時(shí)間過久，DNA基因組已經(jīng)降解。	裂解混合液可在2-8℃保存2-3天，盡量使用新制備的裂解液混合液進(jìn)行PCR。
	模板加入量不適合。	在反應(yīng)體系1-10%范圍內(nèi)優(yōu)化模板加入量。
	PCR循環(huán)數(shù)不足。	適當(dāng)增加PCR的循環(huán)數(shù)，推薦在35-40循環(huán)為佳。因?yàn)槟０鍙?fù)雜，一般PCR反應(yīng)要比用純化的DNA模板多5-10個(gè)循環(huán)為佳。
非特異性擴(kuò)增	PCR退火溫度太低，循環(huán)數(shù)、引物濃度或模板濃度太高。	提高PCR退火溫度，降低PCR循環(huán)數(shù)、引物濃度或模板濃度。
	PCR引物錯(cuò)配。	重新設(shè)計(jì)PCR引物。
	配制PCR反應(yīng)體系時(shí)溫度太高或配制完成后放置時(shí)間太久。	PCR反應(yīng)體系的配制在低溫下進(jìn)行，配制完成后盡快進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
陰性對照出現(xiàn)目的條帶	操作工具或試劑污染。	實(shí)驗(yàn)所有試劑或器材均應(yīng)高壓滅菌。操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。
	樣本間交叉污染。	每個(gè)取樣器只對一個(gè)樣本使用；或取完一個(gè)樣本后，將取樣器刃口浸入2%的次氯酸鈉溶液中，反復(fù)涮洗，然后用干凈的紙巾擦干殘液。

 

 

Ver.CN20250304