高通量測(cè)序技術(shù)的跨越式發(fā)展，使測(cè)序能力大幅上升。在整個(gè)NGS工作流程中，磁珠是必不可少的產(chǎn)品。

磁珠通過(guò)磁顆?；钚曰鶊F(tuán)在一定條件下可與核酸結(jié)合和解離的原理，將樣本中目的片段分離。可實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸樣本的高通量自動(dòng)化操作，廣泛應(yīng)用于基因測(cè)序以及分子診斷領(lǐng)域。

看起來(lái)很簡(jiǎn)單的純化/分選實(shí)驗(yàn)，卻在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中有各種意外的情況。那關(guān)于磁珠產(chǎn)品選擇和產(chǎn)品使用方面有什么需要注意的事項(xiàng)呢？接下來(lái)小翌將從磁珠的外觀、儲(chǔ)存、應(yīng)用和使用效果逐一對(duì)癥分析，希望能幫助大家了解磁珠實(shí)驗(yàn)中的那些事。

Q：如何從磁珠的外觀區(qū)分磁珠是否正常？

A：正常磁珠靜置時(shí)，微珠與buffer分層，聚集在瓶身底部，使用前震蕩混勻，微珠均勻分布在buffer中。非正常磁珠由于 β-巰基乙醇、DTT、pH差值大等因素，影響磁珠的均一性，使得磁珠粘稠，聚集成塊或出現(xiàn)掛壁的現(xiàn)象。

圖1. 正常磁珠外觀圖

圖2. 非正常磁珠外觀圖

Q： 不小心將磁珠放到-20℃，但未結(jié)冰，是否可以繼續(xù)使用？

A：不建議使用。因?yàn)榈蜏貢?huì)破壞磁珠的結(jié)構(gòu)，使得磁珠的抓取效率降低，影響磁珠回收性能。

Q：磁珠未開(kāi)封的時(shí)候4℃保存，開(kāi)封后一直室溫保存使用，是否會(huì)影響磁珠的回收性能？

A：室溫放置對(duì)磁珠的回收性能會(huì)有一定影響，不建議室溫放置太久，使用完后建議4℃保存。PEG分離效果易受pH、溫度等影響。

Q：磁珠分選的原理是什么？

A：第一輪磁珠結(jié)合分子量較大的DNA，通過(guò)丟棄磁珠去除這部分產(chǎn)物；第二輪磁珠結(jié)合剩余產(chǎn)物中分子量較大的DNA，通過(guò)丟棄上清去除分子量較小的DNA。

初始樣品中的很多組分都會(huì)干擾雙輪磁珠分選效果。因此，當(dāng)分選方案執(zhí)行位置不同時(shí)，雙輪磁珠使用量也不盡相同。

Q：產(chǎn)品的主要應(yīng)用是什么？

A：產(chǎn)品主要應(yīng)用于高通量測(cè)序DNA片段的純化和分選。對(duì)于PCR或者酶切DNA產(chǎn)物的純化也可以使用?？梢杂行コ?/span>dNTP，引物，引物二聚體，接頭，接頭二聚體，鹽離子等雜質(zhì)。

Q：產(chǎn)品可以重復(fù)使用嗎？

A：產(chǎn)品不可以重復(fù)使用，乙醇洗脫步驟將影響磁珠表面活性基團(tuán)性能。

Q：與AMPure XP相比，怎么樣？

A：我們的產(chǎn)品制備原材料完全進(jìn)口，可以完美替代AMPure XP Beads。在使用方法，文庫(kù)大小分布和回收效率上，與AMPure XP Beads完全一致，您可以直接按照AMPure XP Beads的操作方式使用，無(wú)需摸索條件。

Q： 磁珠可以吸附ssDNA嗎？

A：可以回收單鏈DNA，具體性能沒(méi)有測(cè)試過(guò)。附圖是Beckman磁珠回收單鏈DNA的數(shù)據(jù)，可以作為參考。

圖3. XP磁珠回收單鏈DNA效果圖

Q： 分選磁珠可以純化gDNA嗎？

A：翌圣分選磁珠測(cè)試過(guò)最大20kb的片段，回收率>90%?；蚪M DNA 未測(cè)試過(guò)，測(cè)試時(shí)，由于大DNA與磁珠結(jié)合的非常緊，建議盡量增加洗脫液體積，避免干燥時(shí)間過(guò)久。

Q: 分選磁珠是否可以進(jìn)行片段產(chǎn)物純化？

A: 根據(jù)客戶反饋結(jié)果，分選磁珠可以進(jìn)行片段產(chǎn)物的純化。0.8×磁珠可以吸附 200 bp 以上的產(chǎn)物，通過(guò)去除上清即可對(duì) 200 bp 以下的片段進(jìn)行去除；1.4×磁珠可以吸附 150 bp 以上的產(chǎn)物，通過(guò)去除上清即可對(duì) 150 bp 以下的片段進(jìn)行去除。

Q：磁珠的DNA結(jié)合能力怎么樣？

A：在目前的磁珠體系中，磁珠的吸附能力均為過(guò)飽和，客戶不必?fù)?dān)心磁珠結(jié)合能力不足的情況。根據(jù)已知的報(bào)道，每1 μL磁珠可以結(jié)合7 μg DNA。

Q： 使用磁珠吸附小片段的時(shí)候，大片段也會(huì)吸附上來(lái)嗎？

A: 磁珠優(yōu)先吸附大片段，增大磁珠投入量時(shí)，磁珠會(huì)在吸附大片段的基礎(chǔ)上增強(qiáng)吸附小片段的能力。

舉例說(shuō)明：參考磁珠純化分選表，100 μL樣本，加入80 μL磁珠Cat#12601,此時(shí)磁珠上吸附的是>350 bp的片段，但是，當(dāng)磁珠投入量至100 μL時(shí)，磁珠上吸附的是>200 bp的片段。

Q：分選磁珠是否可以用于提取DNA？

 A：使用分選磁珠可以實(shí)現(xiàn)直接將樣本裂解后用磁珠將其中的gDNA提取出來(lái)，可能效率沒(méi)有專用試劑盒的高，因?yàn)槲覀冞@款磁珠的定位是在純化和分選。

Q：使用磁珠分選/純化之后，還有小片段殘留是怎么回事？

圖4. 二聚體殘留效果圖

A：小片段殘留大部分是接頭二聚體（127bp）/引物二聚體（80bp）。若純化，降低磁珠比例；若分選：可適當(dāng)降低二輪磁珠比例可有效改善此類情況。

Q：磁珠回收率低可能的原因是什么？

A：1）磁珠與DNA混勻不充分，未能充分吸附。建議反應(yīng)體系充分混勻；

2）磁珠比例不對(duì)，建議按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行選擇合適的比例；

3）孵育時(shí)間不足，保證孵育時(shí)間至少5 min；

4）磁珠分選時(shí)，二輪磁珠吸附的時(shí)候吸到磁珠。可在200 μL 槍頭前串聯(lián) 10μL槍頭用于移液，可防止吸到磁珠；

5）磁珠洗滌時(shí)的乙醇非現(xiàn)配，導(dǎo)致乙醇濃度過(guò)低，建議乙醇濃度不低于70%；

6）干燥過(guò)度：磁珠長(zhǎng)時(shí)間干燥導(dǎo)致表面龜裂，DNA難以洗脫，得率降低；建議干燥時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，表面剛出現(xiàn)龜裂即可；

7）洗脫液體積不足：最終洗脫液應(yīng)完全覆蓋管內(nèi)磁珠。

Q：純化后DNA在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)不理想。

A：由乙醇?xì)埩粢?，可能是操作時(shí)磁珠分離時(shí)間過(guò)短或磁力器磁力較弱，洗脫步驟中吸取上清速度過(guò)快等。建議確保在最后一步洗滌結(jié)束后，溶液中無(wú)殘留乙醇。磁珠可于室溫干燥5-10分鐘，使乙醇完全干燥。

Q: 使用 12601 分選磁珠，分選出的文庫(kù)大小不對(duì)稱是怎么回事？

圖5. 分選文庫(kù)大小不對(duì)稱效果圖

A：操作問(wèn)題，磁珠比例應(yīng)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)，另外移液時(shí)為避免吸到磁珠，底部需殘留 1-2μL 液體。