2019年國家藥監(jiān)局發(fā)布的《醫(yī)療器械注冊(cè)工作》中醫(yī)療器械注冊(cè)申請(qǐng)共計(jì)5877項(xiàng)，體外診斷試劑注冊(cè)申請(qǐng)共計(jì)3227項(xiàng)。而2018年的體外診斷注冊(cè)申請(qǐng)僅817項(xiàng)，特別地在今年對(duì)于體外診斷的需求也刺激了體外診斷市場不斷擴(kuò)張。
圖1. 2017年至2019年體外診斷試劑注冊(cè)項(xiàng)目回顧
數(shù)據(jù)來自國家藥監(jiān)局年度醫(yī)療器械注冊(cè)工作報(bào)告
體外診斷試劑產(chǎn)品的注冊(cè)過程中要求提供申報(bào)產(chǎn)品的分析性能評(píng)估資料，產(chǎn)品性能評(píng)估是產(chǎn)品研發(fā)、制定產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)等過程的重要技術(shù)支持研究過程，并可能對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量造成一定的影響。面對(duì)不斷增加的體外診斷試劑的需求，如何對(duì)有效對(duì)診斷試劑進(jìn)行系統(tǒng)的評(píng)估尤為重要。
目前國際上對(duì)體外診斷試劑的性能評(píng)估通常是以美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化組織（Clinical and Laboratory Standards Institude以下稱為CLSI）的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)，也是美國FDA推薦采用的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，但我國還沒有相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)及指導(dǎo)原則的要求。在國家藥監(jiān)局發(fā)布的《診斷試劑體外診斷試劑分析性能評(píng)估體系指導(dǎo)原則（征求意見稿）》中提出了為進(jìn)一步明確體外診斷試劑分析性能評(píng)估的技術(shù)要求，以明確體外診斷試劑產(chǎn)品性能評(píng)估的技術(shù)要求。體外診斷試劑產(chǎn)品性能評(píng)估包括檢測限、線性范圍、可報(bào)告范圍、準(zhǔn)確度（回收實(shí)驗(yàn)）、準(zhǔn)確度（方法學(xué)比較）、精密度、干擾實(shí)驗(yàn)、穩(wěn)定性、參考區(qū)間共九個(gè)項(xiàng)目。
檢測限（limit of detection）是指檢測方法可檢測出的最低被測量濃度，也稱檢測低限（lower limit of detection）或最小檢出濃度（minimum detectable concentration），有時(shí)也稱為分析靈敏度（analytical sensitivity）
精密度是衡量體外診斷試劑批內(nèi)和批間變異的重要指標(biāo)，通常包括批內(nèi)和批間不精密度。
干擾物質(zhì)是體外診斷試劑使用過程中造成測量誤差的一個(gè)主要原因，針對(duì)體外診斷試劑進(jìn)行的干擾實(shí)驗(yàn)是指通過實(shí)驗(yàn)查找出對(duì)體外診斷試劑測量結(jié)果產(chǎn)生影響的物質(zhì)的過程。干擾實(shí)驗(yàn)評(píng)估資料是評(píng)價(jià)擬上市產(chǎn)品有效性的重要依據(jù)，也是產(chǎn)品注冊(cè)所需的重要申報(bào)資料之一。
穩(wěn)定性評(píng)估資料是評(píng)價(jià)擬上市產(chǎn)品有效性的重要依據(jù)，其中包括對(duì)于儲(chǔ)存穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性進(jìn)行探討。
Hieff® Direct Taq DNA Polymerase（5U/μL）（Cat：10709ES）
高純度：純度>95%，無核酸酶殘留，宿主gDNA殘留量低
良好的批次穩(wěn)定性：嚴(yán)苛的生產(chǎn)流程和質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)，保證不用批次產(chǎn)品性能穩(wěn)定性
穩(wěn)定的生產(chǎn)產(chǎn)能：大規(guī)模生產(chǎn)體系，單批次產(chǎn)能達(dá)g級(jí)；穩(wěn)定供應(yīng)，貨期短
圖2. 上樣量1-5 μL，經(jīng)SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，Hieff® Direct Taq DNA Polymerase 純度大于95%。
圖3. 50 μL反應(yīng)體系中，加入10U Hieff® Direct Taq DNA Polymerase，與500 ng λ DNA/Hind III酶切產(chǎn)物，在37℃孵育4h，酶切產(chǎn)物帶型無變化，無核酸酶殘留。
圖4. 10μl反應(yīng)體系，取10U非熱啟動(dòng)Taq酶，與500ng IL23R 超螺旋質(zhì)粒在37℃孵育4h；電泳觀察帶型變化。結(jié)果顯示無切口酶殘留，表明本品無切口酶殘留。
表1. 磷酸酶活性（pNPP，緩沖液）-200 μL的反應(yīng)緩沖液含1 M二乙醇胺 、0.5 mM MgC12、2.5 mM對(duì)硝基苯磷酸鹽（pNPP）以及至少40 μL標(biāo)準(zhǔn)Taq（不含Mg2+）；通過分光光度法測定并且在37 ℃下4小時(shí)可產(chǎn)生<0.0001單位的堿性磷酸酶活性。10U三批次D-Taq酶磷酸酶殘留均小于0.0001U。
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酶
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用量
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37度反應(yīng)起點(diǎn)OD405
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37度4小時(shí)終點(diǎn)OD405
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磷酸酶
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0.001U
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0.167
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2.798
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磷酸酶
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0.0001U
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0.132
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1.111
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磷酸酶
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0.00001U
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0.13
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0.246
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磷酸酶
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0.000001U
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0.134
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0.158
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磷酸酶
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0.0000001U
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0.126
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0.142
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T19D20C0401
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10U
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0.117
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0.123
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T19D20E1301
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10U
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0.13
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0.138
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T19D20G0301
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10U
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0.13
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0.136
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Taq buffer
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2ul
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0.128
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0.135
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blank
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0.114
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0.129
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表2. 將待檢酶94℃加熱30min、60min之后測定酶活。94℃加熱1小時(shí)仍具有不低于50%的酶活。
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94℃
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加熱時(shí)間
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0min
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30min
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60min
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酶活
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100%
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87%
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50.60%
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圖5. 擴(kuò)增2kb和5kb的片段，電泳檢測。
圖6. 50 μL體系中，加入2U的酶，以無菌ddH2O為模板，擴(kuò)增E.coil 16s rDNA基因。35個(gè)循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1% 瓊脂糖凝膠電泳，EB染色。無擴(kuò)增條帶。
Uracil DNA Glycosylase (UDG/UNG), heat-labile（Cat：10303ES）
10U熱敏UDG中大腸桿菌基因組殘留低于10拷貝
無核酸酶殘留
尿嘧啶是此酶識(shí)別的唯一堿基
圖7. 上樣量為5-20 μL，經(jīng)SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，純度大于95%。
圖8. 在50μL反應(yīng)體系，取1U酶，與500ng lambda DNA/Hind III酶切產(chǎn)物在37℃孵育4h；電泳觀察帶型變化。結(jié)果顯示帶型及條帶深淺與對(duì)照一致，無核酸酶殘留。
圖9. 在10μL反應(yīng)體系，取1U酶，與500ng IL23R 超螺旋質(zhì)粒在37℃孵育4h；電泳觀察帶型變化。結(jié)果顯示，帶型及條帶深淺與對(duì)照一致，無切口酶殘留。
圖10. 10μl反應(yīng)體系，取1U酶，與500 ng 293T RNA 在37℃孵育4h；電泳觀察帶型變化，與陰性帶型一致-合格。
Hifair® V Reverse Transcriptase （Cat：11300ES）
Hifair® V Reverse Transcriptase 是在 Hieff® M-MLV (H-) Reverse Transcriptase 基礎(chǔ)上通過基因工程技術(shù)得到的逆轉(zhuǎn)錄酶，與 Hieff® M-MLV (H-) Reverse Transcriptase 相比，其熱穩(wěn)定性大幅度提高，可耐受高達(dá) 60℃的反應(yīng)溫度，適合具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的 RNA 模板的逆轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，該酶增強(qiáng)了與模板的親和力，適合少量模板以及低拷貝基因的逆轉(zhuǎn)錄。Hifair® VReverse Transcriptase 合成全長 cDNA 的能力也有了提升，可擴(kuò)增長達(dá) 10 kb 的 cDNA。
產(chǎn)品特點(diǎn)
兼容性：適合不同GC含量、不同表達(dá)豐度基因逆轉(zhuǎn)錄
靈敏度高
圖11. 上樣量2 μg，經(jīng)SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，根據(jù)條帶分析純度。純度大于95%。
圖12.在200 U本酶和1 μg Supercoiled pBR322 DNA，37℃下孵育1 h，結(jié)果顯示無核酸內(nèi)切酶殘留。在200 U本酶和1 μg λDNA-Hind Ⅲ，37℃下孵育1 h，結(jié)果顯示DNA的電泳譜帶不發(fā)生變化，無核酸外切酶殘留。
圖13. 在10μl反應(yīng)體系，取1000U 反轉(zhuǎn)錄酶，與500ng IL23R 超螺旋質(zhì)粒在37℃孵育4h。結(jié)果顯示電泳觀察帶型，無變化無切口酶殘留。
圖14. 在50 μL體系中，加入200U的酶，以無菌ddH2O為模板，擴(kuò)增E.coil 16s rDNA基因。35個(gè)循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1% 瓊脂糖凝膠電泳，EB染色。結(jié)果顯示無擴(kuò)增條帶即無大腸桿菌基因組殘留。
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