RNA提取是RT-qPCR實驗成功的首要步驟，RNA的質(zhì)量直接關(guān)乎RT-qPCR實驗的結(jié)果。但是在實驗過程中我們經(jīng)常會碰到RNA提取實驗翻車的情況，主要是因為RNA的分子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定和無處不在的RNase對RNA的降解造成的。

由此可見，想要提取到高質(zhì)量的RNA并非易事。今天，小翌主要從樣本選擇、樣本采集與保存、RNA提取這三個方面來闡述RNA提取過程需注意的關(guān)鍵要點，以輔助后續(xù)的qPCR實驗順利進行。

樣本的選擇

 

 

樣本最好選擇處于生長旺盛期的新鮮細胞，新鮮、生長旺盛的動物組織，新鮮幼嫩的植物組織。

樣本采集和保存

 

 

»  快速處理：獲取樣本后，最好立即提取RNA，或者在液氮中速凍樣本≥1h，之后凍存于-80℃冰箱。

注：液氮速凍需確保組織塊足夠小，在浸入液氮后幾乎立即凍結(jié)，以確保RNase瞬間失活，穩(wěn)定樣本中的RNA。
    

»  RNA穩(wěn)定液處理：若采樣不方便攜帶液氮，可將樣本放入RNA穩(wěn)定液中，迅速滲入組織，滅活內(nèi)源RNase，以穩(wěn)定和保護樣本中的RNA。建議組織樣本大小<0.5 cm，保證RNA穩(wěn)定液可滲透到組織內(nèi)部。一般4℃保存過夜，之后凍存至-80℃冰箱。 （翌圣動植物組織RNA穩(wěn)定液，持久保護組織RNA完好無缺，點擊可產(chǎn)看產(chǎn)品詳情→10604ES60）

注：Trizol為裂解液，可用于保存細胞，但不適用于組織樣本保存。當(dāng)細胞存放在Trizol中需注明每管的細胞數(shù)量。

其他Tips

 

» 避免環(huán)境中RNase的污染

1）實驗臺面最起碼要用75%的酒精擦拭干凈，操作過程中應(yīng)佩帶口罩、手套和帽子等；

2）研缽等器具應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6h或更長時間；槍頭和離心管等耗材要用 DEPC處理或購買RNase-free耗材；

 

» 避免試劑中RNase的污染

提取過程中用到的水/緩沖液要確保是RNase-free的。

 

» 提取RNA的過程需去除gDNA，避免其對后續(xù)RT-qPCR實驗的影響

 

» 根據(jù)樣本和實驗需求，選擇合適的RNA提取方法

 

常見的RNA提取方法

 

1.   沉淀法

» 原理

Trizol中含有苯酚、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇，可裂解樣本釋放核酸，并抑制RNase活性。加入氯仿離心分層，收集上清，經(jīng)異丙醇沉淀得到總RNA

 

» 特點

得率高，樣本適用性廣泛，但是純度相對較低

 

» 推薦貨號

Trieasy (貨號：10606)

 

2.  離心柱法




» 原理

高鹽吸附、低鹽洗脫

» 特點

得率高 ，樣本適用性廣泛，但是純度相對較低

 

 

» 推薦貨號

培養(yǎng)細胞RNA提取試劑盒(貨號：19231）
組織/細胞RNA提取試劑盒（貨號：19221）
多糖多酚植物RNA提取試劑盒（貨號：19292）

 

 

 

在此，給大家介紹一款11min即可完成培養(yǎng)細胞RNA提取的的柱式提取試劑盒：培養(yǎng)細胞RNA提取試劑盒（Cat No.19231）。
 

 

» 產(chǎn)品特點：

 

» 案例展示：

使用培養(yǎng)細胞RNA提取試劑盒（Cat No.19231）和O品牌常規(guī)細胞/組織RNA提取試劑盒各提取2份293T細胞（10^6個細胞）的總RNA。結(jié)果顯示，該試劑盒提取到的目標RNA產(chǎn)量一致，但純度更高，如表1和圖2。

表1. Nanodrop測定RNA濃度

備注：Y1，Y2代表培養(yǎng)細胞RNA提取試劑盒（Cat No.19231）；O1，O2代表O品牌常規(guī)細胞/組織RNA提取試劑盒

 

▲ 圖2a.hGAPDH擴增結(jié)果

 

▲ 圖2b.hBC6擴增結(jié)果

圖2. 培養(yǎng)細胞RNA提取試劑盒的定量結(jié)果與O品牌基本一致。取1 μL洗脫液反轉(zhuǎn)錄，以cDNA的10倍稀釋液為模板，定量測試 hGAPDH  和 hBC6  2個基因

 

綜上，小翌從樣本選擇、樣本采集與保存、RNA提取這三個方面闡述了提取高質(zhì)量RNA的關(guān)鍵要點，下期小翌將講解RNA質(zhì)量評估以及RNA降解對qPCR實驗結(jié)果的影響等方面的內(nèi)容，我們下期不見不散~

 

相關(guān)產(chǎn)品 »

類別	產(chǎn)品名稱	貨號	規(guī)格
RNA提取	TRIeasy™ Total RNA Extraction Reagent TRIeasy™總RNA提取試劑	10606ES60	100mL
	MolPure® Cell RNA Kit 培養(yǎng)細胞RNA提取試劑盒	19231ES50	50T
	MolPure® Cell/Tissue Total RNA Kit 細胞/組織總RNA提取試劑盒	19221ES50	50T
	MolPure® Plant Plus RNA Kit 多糖多酚植物RNA提取試劑盒	19292ES50	50T
逆轉(zhuǎn)錄	Hifair® Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)	11141ES60	100T
qPCR	Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix	11184ES08	5*1mL

 

 

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