化繁為簡！小翌帶你輕松搞定qPCR數(shù)據(jù)分析
熒光定量PCR（qPCR）是實驗室常用的一種技術(shù)，該技術(shù)可以應(yīng)用于基因表達分析、基因分型、 病原體檢測、SNP分析等。qPCR實驗操作簡單，原理易懂，但面對一堆凌亂的數(shù)據(jù)，如何進行結(jié)果分析成了頭疼的問題，今天小翌將帶你學會如何化繁為簡，輕松獲得可以發(fā)表SCI的數(shù)據(jù)！
qPCR常用的分析方法有相對定量和絕對定量，需根據(jù)不同的實驗設(shè)計進行選擇。本期我們關(guān)注的是qPCR常見的應(yīng)用—基因表達分析，一般選擇相對定量法。
假設(shè)目前需要研究光誘導(dǎo)對擬南芥AtSUC2基因表達的影響，以未經(jīng)過任何處理的擬南芥植株作為對照組，實驗組為經(jīng)過一定光誘導(dǎo)處理過的植株，分別提取RNA進行反轉(zhuǎn)錄，以得到的cDNA為模板，選擇擬南芥GAPDH基因作為內(nèi)參，進行qPCR實驗。
需要設(shè)置的qPCR孔如下：
1) NTC用來驗證PCR體系中是否存在污染；
2) NRT是指用未經(jīng)反轉(zhuǎn)錄的RNA作為模板，是對gDNA殘留的控制；
3) 內(nèi)參基因用來校正因樣品初始濃度不同而造成的差異；
4) 而對照樣品的選擇一般有以下幾種情況：
a. 某處理方法對基因表達的影響，將未處理的樣本作為參照樣本；
b. 檢測基因在不同時間的表達差異，將0時刻的樣本作為參照樣本；
c. 比較基因在不同組織中的表達差異，人為選定一個組織作為參照樣本。
這里需要注意的一點是，上面每個材料都設(shè)置了3個PCR孔(1、2、3)，這是PCR重復(fù)，即技術(shù)性重復(fù)，是為了消除操作誤差，正確評估擴增效率。此外還需設(shè)置生物學重復(fù)，即不同的材料（時間、植株、批次、反應(yīng)板）做的同一實驗，目的是校準生物學誤差，分析處理是否具有統(tǒng)計意義。具體到本例中，實驗組和對照組都需要至少再處理兩組擬南芥樣本（A、B、C），分別提RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，再做qPCR，統(tǒng)計時以三個生物學重復(fù)的平均值進行分析。
△△Ct法的特點是只依靠Ct值來計算結(jié)果，但前提是目的基因與內(nèi)參基因的擴增效率較為一致并且都在90-110%之間。
具體的計算公式為：
△Ct= Ct（目的基因）- Ct（內(nèi)參基因）
△△ Ct= △Ct（實驗組）- △Ct（對照組）
RQ=2^-△△Ct
假設(shè)上面研究光誘導(dǎo)對擬南芥AtSUC2基因表達影響的實驗中，qPCR的結(jié)果如下：
計算時，首先我們把對照組的2^-△Ct數(shù)據(jù)求平均值（上圖中為0.00116），然后用2^-△Ct中的每一個數(shù)據(jù)除以這個平均值，即得到2^-△△Ct的值，最后再整理得到平均值與標準差，表明實驗組目的基因表達量相比對照組提高了約9.73倍。
結(jié)果用Graphpad軟件作圖如下：
利用軟件的t檢驗計算出P value=0.0024<0.05，表明具有統(tǒng)計學差異，結(jié)果可信。
在實際應(yīng)用中，由于目的基因與內(nèi)參基因的擴增效率常常是不同的，需要重新設(shè)計引物，優(yōu)化反應(yīng)條件使得擴增效率相同，但其實我們還可以選擇更方便的雙標準曲線法。
這里我們先了解下絕對定量的分析方法。具體的步驟是先通過PCR擴增目的片段，然后將目的片段插入克隆載體中，提取重組質(zhì)粒，待測序正確后即可作為標準品。質(zhì)粒DNA量可用Nanodrop等儀器測定，通過拷貝數(shù)換算公式轉(zhuǎn)換成具體的質(zhì)?？截悢?shù)，然后進行倍比稀釋后擴增。以標準品拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標，以測得的Ct值為縱坐標繪制標準曲線，根據(jù)未知樣品的Ct值就可以計算出其絕對拷貝數(shù)。
拷貝數(shù)計算公式：
拷貝數(shù)=（質(zhì)量÷相對分子質(zhì)量）×6.02×10^23
雙標準曲線法是通過分別構(gòu)建目的基因與內(nèi)參基因的標準品，進行絕對定量并制作標準曲線，計算出未知樣品絕對拷貝數(shù)之后再進行比較，因此準確性更高。
具體的計算公式為：
Q=目的基因拷貝數(shù)/內(nèi)參基因拷貝數(shù)
RQ=Q實驗/Q對照
假設(shè)上面研究光誘導(dǎo)對擬南芥AtSUC2基因表達影響的實驗中，分別構(gòu)建AtSUC2與GAPDH的標準品，制作標準曲線如下：
待測樣品目的基因和內(nèi)參基因的Ct值如下：
計算時，首先將目的基因與內(nèi)參基因的Ct值代入標準曲線的線性關(guān)系中，獲得目的基因與內(nèi)參基因分別在實驗組和對照組中的絕對拷貝數(shù)，然后按公式Q=目的基因拷貝數(shù)/內(nèi)參基因拷貝數(shù)，使得目的基因的表達量均一化。最后按公式RQ=Q實驗/Q對照，計算出RQ= 9.71，表示目的基因在實驗組的表達量比對照組上升9.71倍。
結(jié)果用Graphpad軟件作圖如下：
利用軟件的t檢驗計算出P value=0.0008<0.05，表明具有統(tǒng)計學差異，結(jié)果可信。
本期的qPCR數(shù)據(jù)分析就到這里結(jié)束了，下面小翌為你推薦一波性價比高的產(chǎn)品，讓你的實驗數(shù)據(jù)更加準確可靠，快來pick吧！
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產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品編號 |
規(guī)格 |
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口碑爆款！高靈敏通用預(yù)混液Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix |
11184ES08 |
5×1 mL |
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11185ES08 |
5×1 mL |
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IF>5000經(jīng)典預(yù)混液Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix(No Rox) |
11201ES08 |
5×1 mL |
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IF>5000經(jīng)典預(yù)混液Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix(Low Rox Plus) |
11202ES08 |
5×1 mL |
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IF>5000經(jīng)典預(yù)混液Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix(High Rox Plus) |
11203ES08 |
5×1 mL |
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Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (DNA digester plus) |
11155ES60 |
100 T |
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Hifair® AdvanceFast One-step RT-gDNA Digestion SuperMix for qPCR |
11151ES60 |
100 T |
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11149ES60 |
100 T |
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Hifair® Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) |
11141ES60 |
100 T |
