在上一期中，小翌闡述了RNA提取過程需注意的關(guān)鍵要點(diǎn)以幫助大家提取到高質(zhì)量的RNA（《一文解鎖RT-qPCR實(shí)驗(yàn)之RNA提取攻略》）。那提取完RNA的質(zhì)量到底如何評(píng)估呢？今天我給大家來(lái)分享一下。評(píng)估RNA的質(zhì)量主要包含三個(gè)方面，分別是RNA的濃度、純度和完整性。

首先我們先來(lái)復(fù)習(xí)一下OD260、OD280、OD230的含義。核酸分子所含的嘌呤和嘧啶堿基具有共軛雙鍵，在260nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，因此，核酸的最大吸收波長(zhǎng)為260nm，但它無(wú)法區(qū)分出DNA、RNA、降解核酸、游離核苷酸等雜質(zhì)；蛋白質(zhì)分子中常含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯環(huán)結(jié)構(gòu)，通常在280nm處有最大吸收峰；而碳水化合物，多肽，苯酚、EDTA等污染物的最大吸收峰則在230nm處，如圖1。

 圖1. 核酸、蛋白質(zhì)、污染物的最大吸收峰（圖源網(wǎng)絡(luò)）

對(duì)于RNA的濃度來(lái)說(shuō)，根據(jù)朗伯-比爾定律可計(jì)算出在波長(zhǎng)260nm的紫外線下，1個(gè)OD值的光密度大約相當(dāng)于40µg/ml的RNA^[1]，即RNA的濃度（µg/µl）= OD260×40×稀釋倍數(shù)/1000。比如OD260為0.16，2µl樣本稀釋至200µl，即稀釋倍數(shù)為100，RNA的濃度（µg/µl）= 0.16×40×100/1000µg/µl=0.64µg/µl。

 

由圖2可看出，若泳道上部有明顯的高分子量雜帶，則可能是有DNA的殘留，不建議用于后續(xù)的qPCR實(shí)驗(yàn)，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性造成影響（圖2左）；若在膠孔處有比較亮的著色成分，則是有蛋白質(zhì)的殘留（圖2右）。

除了濃度、純度外，RNA完整性也是判斷RNA質(zhì)量的重要指標(biāo)。RNA完整性一般可通過瓊脂糖凝膠電泳來(lái)進(jìn)行評(píng)估。總RNA中占比達(dá)80%以上的是核糖體RNA（rRNA），因此，膠圖呈現(xiàn)的結(jié)果主要是rRNA。

對(duì)于真核生物來(lái)說(shuō)，高質(zhì)量的RNA通常有三條帶，最亮的是28S，其次是18S，最淡的是5S。28S條帶亮度應(yīng)為18S條帶亮度的2倍(圖3左)，若RNA呈現(xiàn)彌散狀，表明RNA已降解（圖3右）。

小翌在與小伙伴交流的過程中發(fā)現(xiàn)，很多實(shí)驗(yàn)室沒有跑RNA瓊脂糖凝膠電泳的習(xí)慣，也不清楚RNA的電泳需注意哪些要點(diǎn)，小翌在此做些科普：

【1】Freifelder, D., Physical Biochemistry: Applications to Biochemistry & Molecular Biology, W.H. Freeman and Company, CA, 1982, p. 494-536.