金擔(dān)子素A(AbA)助力酵母單/雙雜交研究的篩選標(biāo)記
金擔(dān)子素A (Aureobasidin A，AbA)是從絲狀真菌Aureobasidium pullulans No. R106中分離出來的環(huán)酯肽類抗生素，具有很強(qiáng)的抗真菌能力，在較低的濃度下(0.1-0.5 μg/mL)即可對酵母產(chǎn)生毒性。AbA作用機(jī)制是通過抑制酵母中AUR1基因編碼的肌醇磷酰胺合成酶(inositol phosphorylceramide synthase, IPC synthase)的活性，阻礙神經(jīng)酰胺到肌醇磷酰胺的合成，導(dǎo)致鞘脂類物質(zhì)不足，細(xì)胞膜破裂，從而殺死菌株。對AbA敏感的的真菌種類包括：出牙酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)和黑曲霉(A. niger.)。
圖1 AbA結(jié)構(gòu)式，CAS#127785-64-2
研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母的AUR1基因與構(gòu)巢曲霉的AURA基因具有同源性，都能編碼IPC合成酶，因此，對這兩個基因進(jìn)行突變，能夠賦予菌株很強(qiáng)的AbA抗性，比如：突變基因AUR1-C。AbA非常適合作為篩選陽性克隆的藥物選擇性標(biāo)記，使用上也不需要優(yōu)化條件，且背景極低。AbA抗性也是酵母單/雙雜交研究中理想的報告子，兼容于攜帶相應(yīng)抗性的酵母雜交系統(tǒng)。
酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeast two-hybrid assay)是由Fields和 Song等人根據(jù)真核轉(zhuǎn)錄調(diào)控的特點(diǎn)創(chuàng)建的，能夠快速、直接分析已知蛋白之間的相互作用，在研究抗原和抗體相互作用、發(fā)現(xiàn)新蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能、篩選藥物作用靶點(diǎn)、建立基因組蛋白連鎖圖等方面應(yīng)用廣泛。酵母雙雜交原理是：真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子含有兩個不同的結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA binding domain，DNA-BD)和DNA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(Activation domain，AD)，這兩個結(jié)構(gòu)域可以獨(dú)立分開，功能互不影響。BD和AD分別單獨(dú)作用并不能激活轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，只有當(dāng)二者在空間上充分接近時，才呈現(xiàn)完整的轉(zhuǎn)錄激活因子活性，使下游基因得到轉(zhuǎn)錄。將兩待研究蛋白（蛋白X與蛋白Y）分別與BD 、AD結(jié)構(gòu)域構(gòu)建融合質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入同一酵母細(xì)胞中表達(dá)，如果兩蛋白之間不存在相互作用，則報告基因不會轉(zhuǎn)錄表達(dá)；如果兩個蛋白存在相互作用，則BD與AD兩結(jié)構(gòu)域空間上很接近，從而報告基因得到轉(zhuǎn)錄。
圖2 酵母雙雜交原理圖[1]
酵母單雜交技術(shù)是在酵母雙雜基礎(chǔ)上發(fā)展而來的一種研究核酸-蛋白相互作用的工具，被廣泛用于研究真核細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)調(diào)控，如鑒定已知DNA和已知蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用；分離結(jié)合于目的順式調(diào)控元件或其他短DNA結(jié)合位點(diǎn)的新蛋白質(zhì)；準(zhǔn)確定位已經(jīng)證實(shí)的具有相互作用的DNA結(jié)合位點(diǎn)和對蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。它的基本原理是將已知順式作用元件構(gòu)建到最基本啟動子(minimal promoter，Pmin)的上游，把報告基因連接到Pmin下游。將編碼待測轉(zhuǎn)錄因子cDNA與酵母AD結(jié)構(gòu)域融合表達(dá)載體導(dǎo)入酵母細(xì)胞，該基因產(chǎn)物如果能夠與順式作用元件相結(jié)合，就能激活 Pmin啟動子，使報告基因得到表達(dá)。
圖3 酵母單雜交原理圖[2]
針對酵母單/雙雜交研究，翌圣生物推出產(chǎn)品60231ES Aureobasidin A (AbA) 金擔(dān)子素A，是溶于甲醇的AbA溶液，純度 ≥ 97%，濃度為1 mg/mL。翌圣推薦在酵母單/雙雜交實(shí)驗中AbA抑制濃度為：100-1000 ng/mL，具體的工作濃度取決于宿主細(xì)胞的敏感度（見表1. AbA對各種酵母菌的最低抑菌濃度(MIC)）。
表1 Aureobasidin A對各種酵母菌的最低抑菌濃度
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菌株 |
MIC (ng/mL) |
|
|
S.cerevisiae |
ATCC9763 (diploid) |
200-400 |
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SH3328 (haploid) |
100 |
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Sake yeast (diploid) |
100-200 |
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Shochu yeast (diploid) |
100 |
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Beer yeast (triploid or tetraploid) |
100 |
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Baker’s yeast (diploid) |
200-400 |
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Schizo.pombe |
JY-745 (monoploid) |
100 |
|
C.albicans |
TIMM-0136 (diploid) |
40 |
|
C.tropicalis |
TIMM-0324 (diploid) |
80 |
為研究GmWRKY31蛋白在GmSAGT1基因啟動子上的結(jié)合位點(diǎn)，在酵母單雜實(shí)驗中，將目的DNA序列插入到含有尿嘧啶報告基因Ura3的pBait-AbAi載體中，位于基因AUR1-C的上游，酵母轉(zhuǎn)化相應(yīng)質(zhì)粒后懸浮在0.9% NaCl溶液中，OD600調(diào)整為0.005。隨后，將100 μL樣品涂于含500 ng/mL AbA的平板上，倒置，30℃下培養(yǎng)3-5天。[3]
參考文獻(xiàn)
[1] Paiano A, et al. Yeast Two-Hybrid Assay to Identify Interacting Proteins.Curr Protoc Protein Sci. 2019 Feb;95(1):e70.
[2] John S, et al. Yeast one-hybrid assays: a historical and technical perspective.Methods. 2012 August;57(4): 441-447.
[3] Dong H, et al. Transcriptome analysis of soybean WRKY TFs in response to Peronospora manshurica infection. Genomics. 2019 Dec;111(6):1412-1422.
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