在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室中，我們有時(shí)會發(fā)現(xiàn)，大家用同種細(xì)胞、葉片或者動(dòng)物組織提完RNA后，去進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA卻各有不同。有時(shí)候同門師兄弟喜滋滋地做完實(shí)驗(yàn)?zāi)玫搅讼胍慕Y(jié)果，而我們則會坐在實(shí)驗(yàn)臺前，因?yàn)閏DNA質(zhì)量這一關(guān)卡一籌莫展，腦子里時(shí)不時(shí)飄來一些想法，“差不多的樣本和實(shí)驗(yàn)，同門師兄弟那么順，他們是不是歐皇附體了？”“他們不會背著我半夜起床偷偷練習(xí)反轉(zhuǎn)錄來卷我吧？”……

 

那如何做好反轉(zhuǎn)錄，拿到高質(zhì)量的cDNA，做出漂亮的實(shí)驗(yàn)結(jié)果呢？細(xì)節(jié)很重要，小翌這邊整理了相關(guān)的注意事項(xiàng)和解決方案，分享給大家~

 

1.RNA模板質(zhì)量

RNA模板質(zhì)量對于基因的表達(dá)分析至關(guān)重要， RNA模板質(zhì)量的評定是反轉(zhuǎn)錄中最為關(guān)鍵的一步，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性受RNA純度和完整度的影響。

分光光度計(jì)測定RNA純度

表1. RNA分析的分光光度計(jì)檢測指南

分光光度計(jì)檢測主要用于測定RNA的濃度和純度，但不能確定RNA的完整度和基因組殘留情況。其中，A260/280和A260/230是RNA純度檢測的重要參數(shù)，可根據(jù)其數(shù)值的波動(dòng)，判斷RNA的質(zhì)量是否滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

 

瓊脂糖凝膠電泳測定RNA完整度和純度

圖1.不同質(zhì)量RNA電泳圖

 真核生物的RNA應(yīng)該有三條帶，分別是28S，18S及5S，其中高質(zhì)量的RNA 28S與18S的條帶亮度之比是2：1。若出現(xiàn)條帶彌散的現(xiàn)象，則表明RNA已發(fā)生降解，需要重新提取RNA。
 

圖2.不同純度RNA電泳圖

 泳道上部出現(xiàn)明顯的高分子量條帶，則表明其中存在gDNA殘留；點(diǎn)樣孔中若可以觀察到比較亮的著色成分時(shí)，則表明存在蛋白質(zhì)殘留。

 

2.RNA模板數(shù)量

RNA終濃度一致的情況下，后續(xù)qPCR中加入相同體積的cDNA產(chǎn)物約等于加入等拷貝的DNA。 
 

表2.反轉(zhuǎn)錄體系配制例舉

 

以翌圣Hifair® Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)（Cat #11141）為例，在進(jìn)行第一步殘留gDNA去除時(shí)，需對純度和完整度達(dá)標(biāo)的RNA樣本進(jìn)行計(jì)算，得到加入的RNA溶液體積以及對應(yīng)水的體積（①=1000/RNA濃度，②=15-3-①），以保證后續(xù)qPCR時(shí)初始等量的cDNA。

 

3.cDNA濃度是否需要檢測？

圖3.反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物體系

 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是一個(gè)混合體系，除了目的產(chǎn)物外，含有剩余的引物、RNA、dNTP、各種蛋白和鹽離子成分，這些成分會影響分光光度計(jì)檢測出來的濃度值，導(dǎo)致cDNA濃度的測定結(jié)果意義不大。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，反轉(zhuǎn)錄體系中dNTP 投入量的多少會使cDNA濃度的測定結(jié)果產(chǎn)生較大差異，但最終Ct值幾乎一致，qPCR檢測結(jié)果△Ct＜1。

表3. Nanodrop定量結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

 

圖4.qPCR檢測結(jié)果△Ct＜1，且Ct值與 Nanodrop 定量結(jié)果無線性關(guān)系

 

4.cDNA稀釋幾倍效果好

實(shí)驗(yàn)中Ct值適宜的范圍通常在15-35之間，Ct值小于15，則認(rèn)為擴(kuò)增在基線期范圍內(nèi)，未達(dá)到熒光閾值，Ct值大于35，理論上模板起始拷貝數(shù)小于1，判定為無意義。通常完成反轉(zhuǎn)錄后，其產(chǎn)物直接用來進(jìn)行qPCR時(shí)，會出現(xiàn)Ct值偏小的情況，這時(shí)候需要基于獲得的產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定cDNA的稀釋倍數(shù)。
 

圖5.cDNA模板濃度確認(rèn)預(yù)實(shí)驗(yàn)

建議吸取部分cDNA產(chǎn)物稀釋3-10倍，選用Ct值落在15-30之間的稀釋倍數(shù)作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的cDNA濃度參照。

 

5.結(jié)果異常問題解決方案

重復(fù)實(shí)驗(yàn)中Ct值相比于以往批次結(jié)果都要小

同個(gè)研究中，有時(shí)會出現(xiàn)某一批次生物的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，其內(nèi)參與目的基因Ct值偏小的情況，該情況往往是由于RNA樣本中的gDNA殘留造成的。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，當(dāng)樣本中存在gDNA殘留時(shí)，Ct值往往會偏小。
 

圖6. gDNA對qPCR結(jié)果的影響

當(dāng)出現(xiàn)Ct值偏小時(shí)，可選用帶有g(shù)DNA去除的試劑進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，可消除cDNA產(chǎn)物中g(shù)DNA的干擾。

 

Ct值偏大

1）當(dāng)個(gè)別基因Ct值偏大時(shí)，可能是由于引物特異性不強(qiáng)或基因豐度較低。鑒定引物特異性時(shí)，將cDNA稀釋5個(gè)梯度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。正常來說，擴(kuò)增效率應(yīng)在90~110%之間，如果擴(kuò)增效率不在正常范圍內(nèi)，建議重新設(shè)計(jì)2~3對引物，篩選出擴(kuò)增效率最接近100%的引物。

 

圖7. 引物特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

 

 若基因本身在樣本中豐度低，可提高模板量或者選用高靈敏的qPCR產(chǎn)品。

 2）當(dāng)所有基因Ct值偏大(內(nèi)參&目的基因)時(shí)，往往是因?yàn)镽NA模板的濃度和純度沒有達(dá)標(biāo)。建議用分光光度計(jì)或瓊脂糖凝膠電泳對RNA模板進(jìn)行驗(yàn)證，若出現(xiàn)RNA降解，則需要重新提取。

 

產(chǎn)品推薦

產(chǎn)品定位	產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品貨號
一步完成gDNA去除和反轉(zhuǎn)錄	Hifair® V one-step RT-gDNA digestion SuperMix for qPCR	11142ES
高質(zhì)量cDNA的品質(zhì)之選	Hifair® Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)	11141ES
引物靈活、應(yīng)用廣泛的反轉(zhuǎn)錄試劑盒	Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)	11139ES
高靈敏通用型qPCR Mix	Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix	11184ES
Nature、Science作者的共同選擇	Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix(No Rox)	11201ES
	Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix(Low Rox Plus)	11202ES
	Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix(High Rox Plus)	11203ES