產(chǎn)品簡介

復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒(RCR)檢測試劑盒是用于定量分析檢測各種使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體生產(chǎn)的細(xì)胞治療產(chǎn)品和基因治療產(chǎn)品中可能發(fā)生的復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒的潛在風(fēng)險。

本試劑盒針對逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上特定序列設(shè)計特異性引物，采用qPCR熒光探針原理，專一快速的檢測復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒RCR風(fēng)險情況，其最低定量限可以達(dá)到10 copies/μL水平，最低檢測限可以達(dá)到0.3 copies/μL水平，且配套有RCR DNA Control（DNA定量參考品）。該試劑盒需要與本公司的磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒(Cat#18461ES)配套使用。

 

產(chǎn)品組分

組分編號	組分名稱	41329ES50	41329ES60
41329-A	RCR RT-qPCR Mix（Primer&Probe）	850 μL	1.7 mL
41329-B	RCR RT-qPCR Enzyme Mix	100 μL	200 μL
41329-C	Dilution Buffer	1.8 mL×2管	1.8 mL×4管
41329-D	RCR Control (5×108 copies/μL)	25 μL	50 μL
41329-E	RCR IC	50 μL	100 μL

^*IC：Internal control，內(nèi)部對照。

 

運(yùn)輸和儲存條件

 

1. 所有組分均干冰運(yùn)輸，-25~-15℃保存，有效期2年。其中，41329-A需避光保存。

2. 收到貨后，請檢查共5個組分是否齊全，并立即放入對應(yīng)的保存溫度中儲存。

 

適用機(jī)型

包含但不限于以下儀器：

Bio-Rad：CFX96 Optic Module；

Thermo Scientific：ABI 7500，ABI Quant Studio 5；

上海宏石醫(yī)療科技：SLAN-96S。

 

使用方法

1. RCR DNA定量參考品的稀釋和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

用試劑盒中提供的DNA Dilution Buffer（DNA稀釋液）將RCR DNA Control定量參考品進(jìn)行梯度稀釋^*。

具體操作如下：

1）將試劑盒中的RCR DNA Control和DNA Dilution Buffer置于室溫融化，待完全融化后，輕微振蕩混勻，低速離心10 sec。

2）取7支干凈的1.5 mL離心管，分別標(biāo)記為Std0、Std1、Std2、Std3、Std4、Std5、Std6。

3）在標(biāo)記為Std0的1.5 mL離心管中加90 μL DNA Dilution Buffer和10 μL RCR DNA Control (5×10⁸ copies/μL)，即稀釋為5×10⁷ copies/μL，振蕩混勻后短暫快速離心10 sec，該濃度可分裝置于-25~-15℃短期保存（不超過3個月）^**，使用時避免反復(fù)凍融。

4）在Std1、Std2、Std3、Std4、Std5、Std6管中先分別加入90 μL DNA Dilution Buffer^***，再進(jìn)行梯度稀釋^****，稀釋方法如下：

稀釋管	稀釋比例	終濃度
Std1	10 μL Std0 + 90 μL DNA Dilution Buffer	5×106 copies/μL
Std2	10 μL Std1 + 90 μL DNA Dilution Buffer	5×105 copies/μL
Std3	10 μL Std2 + 90 μL DNA Dilution Buffer	5×104 copies/μL
Std4	10 μL Std3 + 90 μL DNA Dilution Buffer	5×103 copies/μL
Std5	10 μL Std4 + 90 μL DNA Dilution Buffer	5×102 copies/μL
Std6	10 μL Std5 + 90 μL DNA Dilution Buffer	5×101 copies/μL

                 表1 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋

^*每個濃度做3個重復(fù)孔，該試劑可測試5×10¹ copies/μL~5×10⁶ copies/μL線性范圍。若需要，可適當(dāng)擴(kuò)大或縮小線性范圍。

^**為減少反復(fù)凍融次數(shù)和避免污染，建議初次使用時將DNA定量參考品分裝儲存于-25~-15℃。

^***已融化未使用的DNA Dilution Buffer可保存于2~8℃ 7天，若長時間不用，請放置于-25~-15℃。

^****為確保模板完全混勻，每個梯度稀釋時需輕微震蕩混勻約1 min。

2. 樣本加標(biāo)回收質(zhì)控ERC的制備

根據(jù)需要設(shè)置ERC中的RCR DNA標(biāo)準(zhǔn)品濃度（以制備加5×10⁴ copies RCR DNA量的ERC為例），具體操作如下：

1）取100 μL待測樣本加入1.5 mL潔凈的離心管中，再加入10 μL Std4，混勻，標(biāo)記為ERC。

2）加標(biāo)回收ERC和同批待測樣本一起進(jìn)行樣本前處理，制備加標(biāo)回收ERC純化液。

3. 陰性抽提質(zhì)控NCS的制備

根據(jù)實驗設(shè)置陰性抽提質(zhì)控NCS，具體操作如下：

1）取100 μL樣本基質(zhì)溶液（或DNA Dilution Buffer）加入1.5 mL潔凈的離心管中，標(biāo)記為NCS。

2）陰性質(zhì)控NCS和同批待測樣本一起進(jìn)行樣本前處理，制備成陰性質(zhì)控NCS純化液。

4. 無模板對照NTC的制備

根據(jù)實驗設(shè)置無模板對照NTC，具體操作如下：

1）無模板對照NTC無需進(jìn)行樣本前處理，在qPCR法檢測RCR DNA含量階段開始配置即可。

2）每管或孔中的NTC反應(yīng)體系為20 μL Mix混合液{即17 μL RCR qPCR Mix（Primer&Probe）+ 2 μL RCR RT-qPCR Enzyme Mix+1 μL RCR IC} +10 μL Dilution Buffer，建議配置3個重復(fù)孔的量。

5. 反應(yīng)體系

反應(yīng)體系	體系（μL）
RCR qPCR Mix（Primer&Probe）*	17
RCR RT-qPCR Enzyme Mix	2
RCR IC	1
DNA template**	10
總體積***	30

 表2 樣本反應(yīng)體系

^*根據(jù)反應(yīng)孔數(shù)計算本次所需的Mix混合液總量：Mix混合液=（反應(yīng)孔數(shù)+2）×(17+2+1) μL（含有2孔的損失量）。通常，每個樣本做3個重復(fù)孔。

^**反應(yīng)孔數(shù)=（6個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線+1個無模板對照NTC+1個陰性抽提質(zhì)控NCS+待測樣TS個數(shù)+待測樣本對應(yīng)加標(biāo)回收ERC個數(shù)）×3。

NTC (No Template Control)：DNA Dilution Buffer

NCS (Negative Control Solution)：樣本基質(zhì)溶液或DNA Dilution Buffer進(jìn)行樣本前處理后，所得純化液為NCS

TS (Test Sample)：待測樣本

ERC (Extraction Recovery Control)：待測樣本中加入如5×10⁴ copies標(biāo)準(zhǔn)品DNA后進(jìn)行樣本前處理，所得純化液為加標(biāo)回收ERC

^***加樣完成密封好管子后，請低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底，再震蕩混勻5 sec以上，完全混勻反應(yīng)液，再低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底，如有氣泡，需將氣泡排盡。

下圖為參考板位：

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

NTC

待測樣本TS1

待測樣本TS1

待測樣本TS1

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std1

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std1

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std1

B

NTC

待測樣本TS2

待測樣本TS2

待測樣本TS2

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std2

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std2

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std2

C

NTC

待測樣本TS3

待測樣本TS3

待測樣本TS3

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std3

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std3

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std3

D

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std4

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std4

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std4

E

NCS

樣本加標(biāo)ERC1

樣本加標(biāo)ERC1

樣本加標(biāo)ERC1

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std5

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std5

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std5

F

NCS

樣本加標(biāo)ERC2

樣本加標(biāo)ERC2

樣本加標(biāo)ERC2

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std6

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std6

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std6

G

NCS

樣本加標(biāo)ERC3

樣本加標(biāo)ERC3

樣本加標(biāo)ERC3

H

表3 上機(jī)參考板位

該示例是對RCR復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒的qPCR法檢測操作的展示，檢測樣本包括：6個濃度梯度的RCR DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線、1個無模板對照NTC、1個陰性質(zhì)控NCS、3個待測樣本TS、3個樣本加標(biāo)回收ERC。建議每個樣本做3個重復(fù)孔。

6. 擴(kuò)增程序參數(shù)設(shè)置（兩步法）（以ABI公司7500 qPCR儀、軟件版本2.0為例）

1）創(chuàng)建空白新程序，選擇絕對定量檢測模板。

2）創(chuàng)建1個檢測探針，命名為“RCR-DNA”，選擇報告熒光基團(tuán)為“FAM”，猝滅熒光基團(tuán)為“None”；再創(chuàng)建1個檢測探針，命名為“IC”，選擇報告熒光基團(tuán)為“CY5”，猝滅熒光基團(tuán)為“None”。參比熒光為ROX”（參比熒光可根據(jù)儀器型號等情況，選擇是否需要添加）。

3）在“Assign target (s) to the selected wells”面板中，將標(biāo)準(zhǔn)曲線孔的“Task”一欄設(shè)置為“Standard”，并且在“Quantity”一欄分別賦值為“5000000”、“500000”、“50000”、“5000”、“500”、“50”（含義為每孔DNA濃度，單位為copies/μL），并在相應(yīng)“sample name”一欄命名為“5×10⁶copies/μL”、“5×10⁵copies/μL”、“5×10⁴copies/μL”、“5×10³copies/μL”、“5×10²copies/μL”、“5×10¹copies/μL”；將無模板對照NTC孔的“Task”一欄設(shè)置為“NTC”；將陰性質(zhì)控NCS孔、待測樣本TS孔、樣本加標(biāo)回收ERC孔的“Task”一欄設(shè)置為“Unknown”，并且在相應(yīng)的“Sample Name”一欄中分別命名為“NCS”、“TS”、“ERC”，之后點擊“Start Run”，開始儀器運(yùn)行。

4）擴(kuò)增程序設(shè)置：設(shè)置反應(yīng)體積30 μL。

循環(huán)步驟	溫度（℃）	時間	循環(huán)數(shù)
逆轉(zhuǎn)錄	50℃	10 min	1
預(yù)變性	95℃	5 min	1
變性	95℃	15 sec	45
退火/延伸（收集熒光）	60℃	30 sec

表4 擴(kuò)增程序

7. qPCR 結(jié)果分析

1）在“Analysis”的“Amplification Plot”面板中，系統(tǒng)會自動給出“Threshold”，有時系統(tǒng)給出的“Threshold”離

基線太近，導(dǎo)致復(fù)孔之間Ct相差甚遠(yuǎn)，可手動調(diào)節(jié)“Threshold”至合適位置，點擊“Analyze”。此時可在“Multicomponent Plot”初步查看擴(kuò)增曲線的形態(tài)是否正常。

2）在“Analysis”的“Standard Curve”面板中，可讀取標(biāo)準(zhǔn)曲線的R²、擴(kuò)增效率(Eff%)、斜率(Slope)、截距(Intercept)等。正常的標(biāo)曲：R²>0.99，擴(kuò)增效率在90%≤Eff%≤110%范圍內(nèi)，Slope在-3.6~-3.1。

3）在“Analysis”的“View well table”面板中，“Quantity”一欄可讀取無模板對照NTC、陰性質(zhì)控NCS、待測樣本TS、樣本加標(biāo)回收ERC的檢測值，單位為copies/μL，后續(xù)可在檢測報告中進(jìn)行單位換算。

4）結(jié)果分析的參數(shù)設(shè)置需依據(jù)具體的機(jī)型及使用的軟件版本，一般也可由儀器自動判讀。

5）根據(jù)待測樣本TS和樣本加標(biāo)回收ERC的檢測結(jié)果計算加標(biāo)回收率，加標(biāo)回收率要求在50%~150%之間。加標(biāo)回收率計算公式：回收率(%) = {樣本加標(biāo)測定值(eg.copies/µL)-樣本測定值(eg.copies/µL)} x洗脫體積(µL) / DNA加入量理論值(eg.copies) x 100%。

6）陰性質(zhì)控NCS的Ct值應(yīng)為Undetermined或Ct值≥35。

7）無模板對照NTC的檢測結(jié)果應(yīng)為Undetermined或Ct值≥38。

 

注意事項

 

1. 使用本試劑前請仔細(xì)閱讀本說明書，實驗應(yīng)規(guī)范操作，包括樣本處理、反應(yīng)體系的配制及加樣。

2. 每個組分在使用前都應(yīng)充分震蕩混勻，低速離心。

3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

4. 本產(chǎn)品僅作科研用途。

 

Ver.CN20240808