中美歐三國監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)于復(fù)制型病毒的控制階段和檢測(cè)要求基本相同，在產(chǎn)品生產(chǎn)的各個(gè)階段以及在接受基于病毒載體的基因治療的患者后續(xù)監(jiān)測(cè)中進(jìn)行檢測(cè)。并且各監(jiān)管機(jī)構(gòu)推薦的復(fù)制型病毒的檢測(cè)方法均是指示細(xì)胞培養(yǎng)法，該方法是復(fù)制型病毒檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。

在重組腺相關(guān)病毒(rAAV)載體生產(chǎn)過程中，轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒DNA與rAAV會(huì)由于物理接近而導(dǎo)致rAAV載體基因組、Rep/Cap基因以及ITR序列發(fā)生非同源重組，這些重組序列被誤包后就形成了具有復(fù)制能力的AAV，即復(fù)制型腺相關(guān)病毒(rcAAV)。

目前，rcAAV檢測(cè)常采用2種方法：基于細(xì)胞培養(yǎng)的檢測(cè)方法和qPCR快檢法（直接檢測(cè)法）。

FDA的指導(dǎo)原則建議通過全面的質(zhì)量研究確認(rèn)產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，由于下述rcAAV的兩種檢測(cè)方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，可考慮同時(shí)采用原理互補(bǔ)的不同方法進(jìn)行研究。

• 基于細(xì)胞培養(yǎng)的檢測(cè)方法

通過不斷的細(xì)胞傳代使rcAAV實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，之后再利用qPCR或Southern-blot方法進(jìn)行檢測(cè)，保證檢測(cè)到的rcAAV都具有復(fù)制能力，是目前最常用的檢測(cè)方法。

但是該方法也有它的缺陷：檢測(cè)靈敏度依賴于AAV不同血清型對(duì)靶細(xì)胞的感染效率，檢測(cè)值可能低于實(shí)際值；培養(yǎng)方法和檢測(cè)平臺(tái)建立也有難度，需建易感細(xì)胞株、輔助病毒庫等，耗時(shí)長(zhǎng)且投入成本較高。

• qPCR快檢法（直接檢測(cè)法）

對(duì)rAAV原液或終產(chǎn)品提取核酸后，直接利用qPCR法檢測(cè)rcAAV，靶標(biāo)基因一般為ITR、Rep、Cap等的連接序列，可實(shí)現(xiàn)對(duì)rcAAV上兩種基因的檢測(cè)，提高準(zhǔn)確性。

其缺點(diǎn)為：檢測(cè)片段短，不能保證檢測(cè)目標(biāo)具備rcAAV復(fù)制所需完整序列，導(dǎo)致檢出的rcAAV不一定有復(fù)制能力，檢測(cè)值相較實(shí)際值偏高。

因此，針對(duì)rcAAV的檢測(cè)開發(fā)一款既能用于細(xì)胞培養(yǎng)后的終點(diǎn)檢測(cè)，也能用于rcAAV直接檢測(cè)的qPCR試劑盒，對(duì)于實(shí)現(xiàn)兩種檢測(cè)方法的互補(bǔ)驗(yàn)證非常有必要。

針對(duì)上述情況，翌圣生物自主研發(fā)了復(fù)制型腺相關(guān)病毒血清型2 (rcAAV2)檢測(cè)試劑盒，基于熒光探針定量PCR原理，采用qPCR法分別檢測(cè)rAAV末端重復(fù)序列(ITR)（即參考基因Reference）和rcAAV的連接序列（即靶基因Target），實(shí)現(xiàn)對(duì)rAAV和rcAAV的同時(shí)定量檢測(cè)。還研發(fā)了與之配套使用的宿主細(xì)胞殘留DNA樣本前處理試劑盒，以及配套的自動(dòng)化核酸提取儀器。用于定量分析檢測(cè)各種使用AAV2血清型的重組腺相關(guān)病毒載體進(jìn)行基因治療、腫瘤治療及疫苗研發(fā)等產(chǎn)品中可能發(fā)生的復(fù)制型腺相關(guān)病毒(rcAAV)的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

產(chǎn)品資質(zhì)：  

符合法規(guī)：按照EP2.6.7、JP G3和USP 63藥典要求驗(yàn)證，符合國際權(quán)威機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)；

配合審計(jì)：產(chǎn)品生產(chǎn)符合ISO13485質(zhì)量體系標(biāo)準(zhǔn)，有完善的審計(jì)文件；

保障品質(zhì)：試劑盒所需酶原料全自產(chǎn)，且已產(chǎn)業(yè)化，供貨穩(wěn)定；

技術(shù)經(jīng)驗(yàn)積累：TaqMan法有技術(shù)沉淀，使得Kit靈敏度高；

專注產(chǎn)品性能：Taq酶抗體庫，雙封閉抗體提高了Kit特異性、穩(wěn)定性等。

 

產(chǎn)品特點(diǎn)：

抗干擾性：針對(duì)復(fù)雜基質(zhì)，樣本加標(biāo)回收率至少能達(dá)到70-130%；

靈敏度高：定量下限(LLOQ)為2copies/μL，檢測(cè)下限(LLOD)為0.125copies/μL；

精密度高：批內(nèi)重復(fù)性高CV＜10%，批間差異小即中間精密度CV＜15%；

專屬性強(qiáng)：特異性檢測(cè)目的基因序列，不受其他外源基因組DNA干擾；

防干擾強(qiáng)：引入內(nèi)部質(zhì)控(IC)，可排除樣本干擾、反應(yīng)配制異常等，避免假陰性。

驗(yàn)證完善：參考ICH Q2（R2）分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則，可提供完善的驗(yàn)證報(bào)告。

 

驗(yàn)證內(nèi)容：

rcAAV-2檢測(cè)驗(yàn)證項(xiàng)目		參考標(biāo)準(zhǔn)or要求	備注
1、試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）		含有參考基因Reference和靶基因Target的質(zhì)粒DNA
2、線性范圍	標(biāo)曲范圍	參考說明書或?qū)嶋H情況（Reference和Target均是2×101～2×106copies/μL）
	R2	≥0.98（P.s.本試劑盒≥0.99）	藥典要求
	斜率	-3.1~-3.8（P.s.本試劑盒-3.1~-3.6）	藥典要求
	擴(kuò)增效率	90%~110%（P.s.對(duì)應(yīng)的斜率-3.1~-3.6，行業(yè)內(nèi)要求）
3、準(zhǔn)確性	回收率	50%~150%（P.s.本試劑盒70~130%）	藥典要求
4、精密度	重復(fù)性	CV＜10%
	中間精密度	CV＜15%
5、專屬性		不受其他來源基因組DNA的干擾
6、靈敏度	定量限	Reference和Target均是2copies/uL
	檢測(cè)限	Reference和Target均是0.125copies/uL
7、耐用性	儀器適用性	Thermo：ABI 7500、ABI QuantStudio5； Bio-Rad：CFX96 Optic Module； 上海宏石：SLAN-96S.
8、穩(wěn)定性	加速穩(wěn)定性	37℃穩(wěn)定14天，2~8℃穩(wěn)定30天
	反復(fù)凍融	≥10次
	有效期	-25~-15℃保存2年
9、空白限	無模板對(duì)照（NTC）	重復(fù)48次qPCR擴(kuò)增曲線CT≥40
	陰性抽提對(duì)照（NCS）	重復(fù)48次qPCR擴(kuò)增曲線CT≥40

 

產(chǎn)品信息：

產(chǎn)品	貨號(hào)	品名	規(guī)格
樣本前處理 試劑盒	18461ES	MolPure® Magnetic Residual DNA Sample Preparation Kit 磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒（瓶裝）	25T/100T
	18467ES	MolPure® Mag48 Sample Preparation Kit FN 磁珠法48孔樣本前處理試劑盒FN（預(yù)封裝)	3×16T/ 6×16T
核酸提取儀器	80511ES	48通道自動(dòng)化核酸提取儀	48通量
rcAAV-2檢測(cè)試劑盒	41327ES	Replication-competent AAV Serotype 2 (rcAAV2) Detection Kit 復(fù)制型腺相關(guān)病毒血清型2 (rcAAV2)檢測(cè)試劑盒	50T/100T