CHO宿主細胞DNA殘留檢測試劑盒是用于定量分析檢測各種生物制品的中間品、半成品和成品中的CHO殘留DNA含量的試劑盒。

本試劑盒采用探針法熒光定量PCR原理，可專一快速的檢測CHO細胞的殘留DNA，其最低檢測限可以達到fg水平。該試劑盒可與本公司的磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒（Cat#18461ES/18462ES）配套使用。

 

產品組分

組分編號	組分名稱	產品編號/規(guī)格
		41301ES50（50T）	41301ES60（100T）
41301-A	CHO qPCR mix	1 mL	2 mL
41301-B	DNA Dilution Buffer	2×2 mL	4×2 mL
41301-C	CHO DNA Control（30 ng/μL）	25 μL	50 μL

【注】：本試劑盒不含ROX參比染料，若您目前使用的Real Time PCR擴增儀需要添加ROX參比染料，推薦您購買本公司的50× ROX Reference Dye（Cat#10200ES）。

 

運輸和保存方法

1.所有組分均干冰運輸，-20℃保存，有效期2年。

 2. 收到貨后，請檢查共3個組分是否齊全，并立即放入對應的保存溫度中儲存。

 

注意事項

1. 使用本試劑前請仔細閱讀本說明書，實驗應規(guī)范操作，包括樣本處理、反應體系的配制及加樣。

2. 加樣和配液步驟盡量都在冰上操作。

3. 每個組分在使用前都應充分震蕩混勻，低速離心。

4. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

5. 本產品僅作科研用途。

 

適用機型

包含但不限于以下儀器：

Bio-Rad：CFX96 Optic Module；

Thermo Scientific：ABI 7500；ABI Quant Studio 5；ABI Step OnePlus.

 

使用方法

一、CHO DNA定量參考品的稀釋和標準曲線的制備

用試劑盒中提供的DNA稀釋液將DNA定量參考品進行梯度稀釋，稀釋濃度依次為300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL、3 fg/μL。

具體操作如下：

1. 將試劑盒中的DNA 定量參考品和DNA稀釋液置于冰上融化，待完全融化后，輕微振蕩混勻，低速離心10 sec。

2. 取7支潔凈的1.5 mL離心管，分別標記為 3 ng/μL，①，②，③，④，⑤，⑥。

3. 在標記為3 ng/μL的1.5mL離心管中加入90 μL DNA 稀釋液和10 μL DNA 定量參考品（30 ng/μL），即稀釋為3 ng/μL，振蕩混勻后短時間快速離心10 sec，該濃度可分裝置于-20℃短期保存（不超過3個月），使用時避免反復凍融。

4. 在 ①，②，③，④，⑤，⑥ 管中先分別加入90 μL DNA稀釋液，再進行梯度稀釋，稀釋方法如下：

稀釋管	稀釋比例	終濃度
①	10 μL 3 ng/μL+90 μL DNA 稀釋液	300 pg/μL
②	10 μL ①+90 μL DNA 稀釋液	30 pg/μL
③	10 μL ②+90 μL DNA 稀釋液	3 pg/μL
④	10 μL ③+90 μL DNA 稀釋液	300 fg/μL
⑤	10 μL ④+90 μL DNA 稀釋液	30 fg/μL
⑥	10 μL ⑤+90 μL DNA 稀釋液	3 fg/μL

【注】：

1. 每個濃度做3個復孔，該試劑可測試3 fg/μL-300 pg/μL線性范圍。若需要，可適當擴大或縮小線性范圍。

2. 為減少反復凍融次數(shù)和避免污染，建議初次使用時將DNA定量參考品分裝儲存于-20℃。

3. 已融化未使用的 DNA 稀釋液可保存于2-8 ℃ 7天，若長時間不用，請放置于-20℃。

4. 為確保模板完全混勻，每個梯度稀釋時需輕微震蕩混勻約1 min。

二、樣本加標回收質控QC的制備

根據(jù)需要設QC中的CHO DNA標準品濃度（以制備加3 pg/μL DNA量的樣本加標回收為例），具體操作如下：

1. 取100 μL待測樣本加入1.5 mL潔凈的離心管中，再加入10μL 溶液③，混勻，標記為加標回收QC。
2. 加標回收QC和同批待測樣本一起進行樣本前處理，制備加標回收QC純化液。

三、標準品回收質控QC的制備（可選）

根據(jù)需要設QC中的CHO DNA標準品濃度（以制備加3 pg/μL DNA量的標準品回收為例），具體操作如下：

1. 取100 μL 溶液③加入1.5 mL潔凈的離心管中，標記為標準品回收QC。
2. 標準品回收QC和同批待測樣本一起進行樣本前處理，制備標準品回收QC純化液。

四、陰性質控NCS的制備

根據(jù)實驗設置陰性質控，具體操作如下：

1. 取100 μL樣本基質溶液（或DNA 稀釋液）加入1.5 mL潔凈的離心管中，標記為陰性質控NCS。
2. 陰性質控NCS和同批待測樣本一起進行樣本前處理，制備成陰性質控NCS純化液。

五、無模板對照NTC的制備

根據(jù)實驗設置無模板對照NTC，具體操作如下：

1. 無模板對照NTC無需進行樣本前處理，在qPCR法檢測殘留DNA含量階段開始配置即可。
2. 每管或孔中的NTC樣本為20 μL CHO qPCR Mix + 20 μL DNA Dilution Buffer，建議配置3個重復孔的量。

六、反應體系

組分	體積（μL）
CHO qPCR Mix	20
DNA template	20
總體積	40

【注】：

1. 根據(jù)反應孔數(shù)計算本次所需的qPCR Mix總量：qPCR Mix =（反應孔數(shù)+2）×20 μL（含有2孔的損失量）。通常，每個樣本做3個重復孔。

2. 加樣完成密封好管子后，請先低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底，再震蕩混勻5 sec以上，完全混勻反應液，再低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底，如有氣泡，需將氣泡排盡。

下圖為參考板位：

該示例是對CHO殘留DNA qPCR法檢測操作的展示，檢測樣本包括：1個無模板對照NTC、6個濃度梯度的DNA標準曲線、3個樣本加標回收QC、3個待測樣本、3個標準品回收QC（可選）、3個陰性質控NCS（1個即可）。建議每個樣本做3個重復孔。

七、擴增程序參數(shù)設置（兩步法）（以Bio-Rad公司CFX 96 qPCR儀、軟件版本4.1.2433.1219為例）

1. 創(chuàng)建空白新程序，選擇絕對定量檢測模板。
2. 創(chuàng)建1個檢測探針，命名為“CHO-DNA”，選擇“run setup”欄中的“select run type”下方的“user-define”，在“run setup”界面中開始程序、板位、通道的設置：

2.1 首先，在“protocol”下點擊“Create New”開始設置PCR程序，設置好后點擊“OK”，保存程序文件。

2.2 點擊“Next”或者“plate”進入孔位設置界面，點擊“create new”，在“Scan Mode”中可以選擇“All Channels”或者“SYBR/FAM Only”選項。用鼠標勾選反應格，點擊“select fluorophores”選項，勾選“FAM”后點擊“OK”，在“sample type”選項下選擇“unknow”（或其他樣本類型），勾選“target name欄下的“load”右邊的框，同時根據(jù)個人需求設置“target name”，也可不設置。根據(jù)個人需求在選項“Sample names”和“Biological Group”中輸入樣本名稱和組別，也可不設置。點擊“OK”保存好最后的結果文件。

2.3 點擊“Next”或“Start run”，開始儀器運行。

3. 擴增程序設置：設置反應體積40 μL。

循環(huán)步驟	溫度（℃）	時間	循環(huán)數(shù)
預變性	95 ℃	5 min	1
變性	95 ℃	15 sec	40
退火/延伸（收集熒光）	60 ℃	30 sec

八、qPCR 結果分析

1. 上機結束后，在程序的右上角點擊“plate setup” 欄下的“view/edit plate”，選中標準品的反應格，在右側的“sample type”欄下選擇“standard”，設置好每個梯度的重復孔，在“loda concentration”下輸入所做的濃度后按“enter”鍵確認，依次將標準品的梯度設置完成。
2. 點擊“OK”，返回到初始界面，即可讀取標準曲線的R²、擴增效率（Eff%）、斜率（Slope）、截距（Intercept）等。正常的標曲：R²＞0.99；擴增效率在90%≤Eff%≤110%范圍內；Slope在-3.4左右。
3. 根據(jù)設置的樣本名稱和組別，讀取無模板對照NTC、陰性質控NCS、待測樣本和樣本加標回收等的檢測值，單位為fg/μL，后續(xù)可在檢測報告中將單位換算成pg/μL或pg/mL。

HB221226