E.coli宿主細(xì)胞DNA殘留檢測(cè)試劑盒是用于定量分析檢測(cè)各種生物制品的中間品、半成品和成品中的E.coli殘留DNA含量的試劑盒。

本試劑盒采用探針法熒光定量PCR原理，可專一快速的檢測(cè)E.coli細(xì)胞的殘留DNA，其最低檢測(cè)限可以達(dá)到fg水平。該試劑盒需可與本公司的磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒（Cat#18461ES/18462ES）配套使用。

 

產(chǎn)品組分

組分編號(hào)	組分名稱	產(chǎn)品編號(hào)/規(guī)格
		41304ES50（50T）	41304ES60（100T）
41304-A	E.coli qPCR mix	0.9 mL	1.8 mL
41304-B	E.coli Primer&probe mix	100 μL	200 μL
41304-C	DNA Dilution Buffer	2×2 mL	4×2 mL
41304-D	E.coli DNA Control（30 ng/μL）	25 μL	50 μL

【注】：本試劑盒不含ROX參比染料，若您目前使用的Real Time PCR擴(kuò)增儀需要添加ROX參比染料，推薦您購(gòu)買本公司的50× ROX Reference Dye（Cat#10200ES）。

 

運(yùn)輸和保存方法

1. 所有組分均干冰運(yùn)輸，-20℃保存，有效期2年。

2. 收到貨后，請(qǐng)檢查共4個(gè)組分是否齊全，并立即放入對(duì)應(yīng)的保存溫度中儲(chǔ)存。

 

注意事項(xiàng)

1. 使用本試劑前請(qǐng)仔細(xì)閱讀本說明書，實(shí)驗(yàn)應(yīng)規(guī)范操作，包括樣本處理、反應(yīng)體系的配制及加樣。

2. 加樣和配液步驟盡量都在冰上操作。

3. 每個(gè)組分在使用前都應(yīng)充分震蕩混勻，低速離心。

4. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

5. 本產(chǎn)品僅作科研用途。

 

適用機(jī)型

包含但不限于以下儀器：

Bio-Rad：CFX96 Optic Module；

Thermo Scientific：ABI 7500；ABI Quant Studio 5；ABI Step OnePlus.

 

使用方法

一、E.coli DNA定量參考品的稀釋和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

用試劑盒中提供的DNA稀釋液將DNA定量參考品進(jìn)行梯度稀釋，稀釋濃度依次為300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL。

具體操作如下：

1. 將試劑盒中的DNA定量參考品和DNA稀釋液置于冰上融化，待完全融化后，輕微振蕩混勻，低速離心10 sec。

2. 取6支潔凈的1.5 mL離心管，分別標(biāo)記為3 ng/μL，①，②，③，④，⑤。

3. 在標(biāo)記為3 ng/μL的1.5 mL離心管中加入90 μL DNA稀釋液和10 μL DNA定量參考品（30 ng/μL），即稀釋為3 ng/μL，振蕩混勻后短時(shí)間快速離心10 sec，該濃度可分裝置于-20℃短期保存（不超過3個(gè)月），使用時(shí)避免反復(fù)凍融。

4. 在 ①，②，③，④，⑤ 管中先分別加入90 μL DNA稀釋液，再進(jìn)行梯度稀釋，稀釋方法如下：

稀釋管	稀釋比例	終濃度
①	10 μL 3 ng/μL+90 μL DNA Dilution Buffer	300 pg/μL
②	10 μL ①+90 μL DNA Dilution Buffer	30 pg/μL
③	10 μL ②+90 μL DNA Dilution Buffer	3 pg/μL
④	10 μL ③+90 μL DNA Dilution Buffer	300 fg/μL
⑤	10 μL ④+90 μL DNA Dilution Buffer	30 fg/μL

【注】：

1. 每個(gè)濃度做3個(gè)復(fù)孔，該試劑可測(cè)試30 fg/μL-300 pg/μL線性范圍。若需要，可適當(dāng)擴(kuò)大或縮小線性范圍。

2. 為減少反復(fù)凍融次數(shù)和避免污染，建議初次使用時(shí)將DNA定量參考品分裝儲(chǔ)存于-20℃。

3. 已融化未使用的 DNA 稀釋液可保存于2-8 ℃ 7天，若長(zhǎng)時(shí)間不用，請(qǐng)放置于-20℃。

4. 為確保模板完全混勻，每個(gè)梯度稀釋時(shí)需輕微震蕩混勻約1 min。

二、樣本加標(biāo)回收質(zhì)控QC的制備

根據(jù)需要設(shè)QC中的E.coli DNA標(biāo)準(zhǔn)品濃度（以制備加3 pg/μL DNA量的樣本加標(biāo)回收為例），具體操作如下：

1. 取100 μL待測(cè)樣本加入1.5 mL潔凈的離心管中，再加入10 μL溶液③，混勻，標(biāo)記為加標(biāo)回收QC。
2. 加標(biāo)回收QC和同批待測(cè)樣本一起進(jìn)行樣本前處理，制備加標(biāo)回收QC純化液。

三、標(biāo)準(zhǔn)品回收質(zhì)控QC的制備（可選）

根據(jù)需要設(shè)QC中的E.coli DNA標(biāo)準(zhǔn)品濃度（以制備加3 pg/μL DNA量的標(biāo)準(zhǔn)品回收為例），具體操作如下：

1. 取100 μL 溶液③加入1.5 mL潔凈的離心管中，標(biāo)記為標(biāo)準(zhǔn)品回收QC。
2. 標(biāo)準(zhǔn)品回收QC和同批待測(cè)樣本一起進(jìn)行樣本前處理，制備標(biāo)準(zhǔn)品回收QC純化液。

四、陰性質(zhì)控NCS的制備

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性質(zhì)控，具體操作如下：

1. 取100 μL樣本基質(zhì)溶液（或DNA 稀釋液）加入1.5 mL潔凈的離心管中，標(biāo)記為陰性質(zhì)控NCS。
2. 陰性質(zhì)控NCS和同批待測(cè)樣本一起進(jìn)行樣本前處理，制備成陰性質(zhì)控NCS純化液。

五、無(wú)模板對(duì)照NTC的制備

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置無(wú)模板對(duì)照NTC，具體操作如下：

1. 無(wú)模板對(duì)照NTC無(wú)需進(jìn)行樣本前處理，在qPCR法檢測(cè)殘留DNA含量階段開始配置即可。
2. 每管或孔中的NTC樣本為20 μL Mix混合液（即18 μL E.coli qPCR mix + 2μL E.coli Primer&probe mix）+ 20 μL DNA Dilution Buffer，建議配置3個(gè)重復(fù)孔的量。

六、反應(yīng)體系

組分	體積（μL）
E.coli qPCR mix	18
E.coli Primer&probe mix	2
DNA template	20
總體積	40

【注】：

1. 根據(jù)反應(yīng)孔數(shù)計(jì)算本次所需的Mix混合液總量：Mix混合液 =（反應(yīng)孔數(shù)+2）× (18+2) μL（含有2孔的損失量）。通常，每個(gè)樣本做3個(gè)重復(fù)孔。

2. 加樣完成密封好管子后，請(qǐng)先低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底，再震蕩混勻5 sec以上，完全混勻反應(yīng)液，再低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底，如有氣泡，需將氣泡排盡。

下圖為參考板位：

該示例是對(duì)E.coli殘留DNA qPCR法檢測(cè)操作的展示，檢測(cè)樣本包括：1個(gè)無(wú)模板對(duì)照NTC、5個(gè)濃度梯度的DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線、3個(gè)樣本加標(biāo)回收QC（即加樣回收QC）、3個(gè)待測(cè)樣本、3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品回收QC（可選）、3個(gè)陰性質(zhì)控NCS（1個(gè)即可）。建議每個(gè)樣本做3個(gè)重復(fù)孔。

七、擴(kuò)增程序參數(shù)設(shè)置（兩步法）（以ABI公司7500 qPCR儀、軟件版本2.0為例）

1. 創(chuàng)建空白新程序，選擇絕對(duì)定量檢測(cè)模板。
2. 創(chuàng)建1個(gè)檢測(cè)探針，命名為“E.coli-DNA”，選擇報(bào)告熒光基團(tuán)為“FAM”，猝滅熒光基團(tuán)為“none”。
3. 在“Assign target (s) to the selected wells”面板中，將標(biāo)準(zhǔn)曲線孔的“Task”一欄設(shè)置為“Standard”，并且在“Quantity” 一欄分別賦值為“300000”、“30000”、“3000”、“300”、“30”（含義為每孔的DNA濃度，單位為fg/μL），并且在相應(yīng)的“sample name”一欄中命名為“300 pg/μL”、“30 pg/μL”、“3 pg/μL”、“300 fg/μL”、“30 fg/μL”；將無(wú)模板對(duì)照NTC孔的“Task”一欄設(shè)置為“NTC”；將陰性質(zhì)控NCS孔、待測(cè)樣本孔、樣本加標(biāo)回收QC孔的“Task”一欄設(shè)置為“Unknown”，并且在相應(yīng)的“Sample Name”一欄中分別命名為“NCS”、“TS”、“QC”，之后點(diǎn)擊“Start Run”，開始儀器運(yùn)行。

     4. 擴(kuò)增程序設(shè)置：設(shè)置反應(yīng)體積40 μL。

循環(huán)步驟	溫度（℃）	時(shí)間	循環(huán)數(shù)
預(yù)變性	95℃	10 min	1
變性	95℃	15 sec	40
退火/延伸（收集熒光）	60℃	30 sec

八、qPCR結(jié)果分析

1.在“Analysis”的“Amplification Plot”面板中，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)給出Threshold，有時(shí)系統(tǒng)給出的Threshold離基線太近，導(dǎo)致復(fù)孔之間Ct相差甚遠(yuǎn)，可手動(dòng)調(diào)節(jié)Threshold 至合適位置，點(diǎn)擊“Analyze”。此時(shí)可在“Multicomponent Plot”初步查看擴(kuò)增曲線的形態(tài)是否正常。

2. 在“Analysis”的“Standard Curve”面板中，可讀取標(biāo)準(zhǔn)曲線的R²、擴(kuò)增效率（Eff%）、斜率（Slope）、截距（Intercept）等。正常的標(biāo)曲：R²＞0.99；擴(kuò)增效率在90%≤Eff%≤110%范圍內(nèi)；Slope在-3.4左右。

3. 在“Analysis”的“View well table”面板中，“Quantity”一欄可讀取無(wú)模板對(duì)照NTC、陰性質(zhì)控NCS、待測(cè)樣本TS、樣本加標(biāo)回收QC的檢測(cè)值，單位為fg/μL，后續(xù)可在檢測(cè)報(bào)告中將單位換算成pg/μL或pg/mL。

 

HB221226