產(chǎn)品說明書
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已發(fā)表文獻(xiàn)
嘌呤霉素(Puromycin)是由白黑鏈霉菌(Streptomyces alboniger)發(fā)酵代謝產(chǎn)生的一種氨基糖苷類抗生素，通過抑制蛋白質(zhì)合成而殺死革蘭氏陽性菌，各種動物和昆蟲細(xì)胞。某種特殊情況下有效作用大腸桿菌。作用機(jī)制在于嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3´末端的類似物，能夠與核糖體的A位點結(jié)合并摻入到延伸的肽鏈中。嘌呤霉素同A位點結(jié)合后，不會參與隨后的任何反應(yīng)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的提前終止并釋放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。
嘌呤霉素產(chǎn)生菌Streptomyces alboniger內(nèi)發(fā)現(xiàn)的pac基因編碼嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAC)，賦予機(jī)體對嘌呤霉素產(chǎn)生抗性。這一特性如今普遍應(yīng)用于篩選特定攜帶pac基因質(zhì)粒的哺乳動物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。
嘌呤霉素在細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選中的普遍應(yīng)用與慢病毒載體的特性有關(guān)，現(xiàn)在商業(yè)化的慢病毒載體多數(shù)都攜帶pac基因。在某些特定情況下，嘌呤霉素亦可以用來篩選轉(zhuǎn)化攜帶pac基因質(zhì)粒的大腸桿菌菌株。
本品是無菌的、溶于蒸餾水的嘌呤霉素鹽酸鹽溶液，濃度為10 mg/mL（10 mg/mL in H2O），可直接用培養(yǎng)基或其他緩沖溶液稀釋使用，適用于細(xì)胞培養(yǎng)，常用工作濃度為1~10 µg/mL。
產(chǎn)品信息
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貨號 |
60209ES10/60209ES50/60209ES60/60209ES76 |
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規(guī)格 |
1×1 mL/5×1 mL/10×1 mL/50×1 mL |
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CAS號（CAS NO.） |
58-58-2 |
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分子式（Molecular Fomular） |
C22H29N7O5·2HCl |
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分子量（Molecular Weight） |
544.43 g/mol |
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純度（Purity） |
≥98% |
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外觀（Appearance） |
溶液 |
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濃度 （Concentration） |
10 mg/mL（溶于水） |
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結(jié)構(gòu)（Structure） |
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組分信息
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組分名稱 |
60209ES10 |
60209ES50 |
60209ES60 |
60209ES76 |
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規(guī)格 |
1×1 mL |
5×1 mL |
10×1 mL |
50×1 mL |
儲存條件
-25~-15℃保存，有效期1年。
使用說明
1. 建議使用濃度
哺乳動物細(xì)胞：1~10 μg/mL，最佳濃度需要?dú)缜€來確定。推薦濃度，請看表1。
大腸桿菌：LB瓊脂培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化pac基因的大腸桿菌，使用濃度為125 μg/mL。
【注】：使用嘌呤霉素篩選大腸桿菌穩(wěn)轉(zhuǎn)株需要精確的pH值調(diào)節(jié)，而且受宿主細(xì)胞本身的影響。
表1 嘌呤霉素鹽酸鹽的推薦濃度
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細(xì)胞系 |
嘌呤霉素濃度 |
參考文獻(xiàn) |
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B16（小鼠黑素細(xì)胞） |
1~2 μg/mL |
[1],[2] |
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HEK293（人胚胎腎細(xì)胞） |
0.5~10 μg/mL |
[3] |
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HeLa（人宮頸癌細(xì)胞） |
1~10 μg/mL |
[4]，[5] |
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MEF（小鼠成纖維細(xì)胞） |
1-5 μg/mL |
[4] |
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HepG2（人肝細(xì)胞癌） |
0.5~5 μg/mL |
[6]，[7] |
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A549（肺癌細(xì)胞） |
1.5 μg/mL |
[8] |
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人胚胎干 (ES) 細(xì)胞 |
0.5~5 μg/mL |
[9] |
- 嘌呤霉素殺滅曲線的確定（以shRNA轉(zhuǎn)染或者慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)為例）
嘌呤霉素有效篩選濃度跟細(xì)胞類型、生長狀態(tài)、細(xì)胞密度、細(xì)胞代謝情況及細(xì)胞所處細(xì)胞周期位置等有關(guān)。為了篩選到穩(wěn)定表達(dá)的shRNA細(xì)胞株，確定殺死未轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的最低濃度嘌呤霉素至關(guān)重要。建議初次做實驗的客戶一定要建立適合自身實驗體系的殺死曲線(kill curve)。
1）Day 1：24孔板內(nèi)以5~8×104 cells/孔的密度鋪板，鋪足夠量的孔，以確保后續(xù)的梯度實驗的進(jìn)行，37℃細(xì)胞孵育過夜。
2）Day 2：①準(zhǔn)備篩選培養(yǎng)基：含不同濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基（如0~15 μg/mL，至少5個梯度）；②往孵育過夜后的細(xì)胞內(nèi)更換新鮮配制的篩選培養(yǎng)基；之后37℃孵育細(xì)胞。
3）Day 4：更換新鮮的篩選培養(yǎng)基，并觀察細(xì)胞存活率。
4）根據(jù)細(xì)胞的生長狀態(tài)，約2-3天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基。
5）每日監(jiān)測細(xì)胞，觀察存活細(xì)胞率，確定抗生素篩選開始4~6天內(nèi)有效殺死非轉(zhuǎn)染或所有非轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的藥物最低濃度。
3. 哺乳動物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選
等轉(zhuǎn)染含有pac基因的質(zhì)粒后，細(xì)胞在含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基中增殖，以篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子。
1）細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，將細(xì)胞（原樣或稀釋）置于含有適當(dāng)濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
【注】：當(dāng)細(xì)胞處于分裂活躍期時，抗生素作用最明顯。細(xì)胞過于密集，抗生素產(chǎn)生的效力會明顯下降。最好進(jìn)行細(xì)胞分盤使其密度不超過25%。
2）每隔2~3天，移除和更換含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基。
3）篩選7天后評估細(xì)胞形成的病灶。病灶可能需要額外的一周或者更多時間，這依賴于宿主細(xì)胞系和轉(zhuǎn)染篩選效率。
【注】：每日進(jìn)行細(xì)胞生長狀態(tài)的觀察。嘌呤霉素的篩選至少需要48 h，有效濃度嘌呤霉素的篩選周期一般在3-10天。
4）轉(zhuǎn)移和放置5~10個抗性克隆到一個35 mm的培養(yǎng)皿中，用選擇培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7天。此次富集培養(yǎng)是為日后的細(xì)胞毒性實驗做準(zhǔn)備。
注意事項
1.嘌呤霉素為有毒化合物，操作時請小心拿放。
2.為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
3.本產(chǎn)品僅用于科研用途，禁止用于人身上。
參考文獻(xiàn)
[1] Furge KA. et al., 2001. Suppression of Ras-mediated tumorigenicity and metastasis through inhibition of the Met receptor tyrosine kinase. PNAS 98:10722-7.
[2] Díaz J. et al., 2014.Rab5 is required in metastatic cancer cells for Caveolin-1-enhanced Rac1 activation, migration and invasion.. J Cell Sci. 127:2401-6.
[3] Rössger K. et al., 2013. Reward-based hypertension control by a synthetic brain-dopamine interface. PNAS, 110:18150-5.
[4] Kamer I. et al., 2005. Proapoptotic BID Is an ATM effector in the DNA-damage response Cell. 122:593-603.
[5] Charnaux N. et al., 2005. RANTES (CCL5) induces a CCR5-dependent accelerated shedding of syndecan-1 (CD138) and syndecan-4 from HeLa cells and forms
[6] Gao J , Zhao N , Knutson M D , et al. The Hereditary Hemochromatosis Protein, HFE, Inhibits Iron Uptake via Down-regulation of Zip14 in HepG2 Cells[J]. Journal of Biological Chemistry, 2008, 283(31):21462-8.
[7] Huang J , Dibble C C , Matsuzaki M , et al. The TSC1-TSC2 complex is required for proper activation of mTOR2[J]. Molecular and Cellular Biology, 2008, 28(12):4104-4115.
[8] Nasser M W , Datta J , Nuovo G , et al. Nasser MW, Datta J, Nuovo G, Kutay H, Motiwala T, Majumder S, Wang B, Suster S, Jacob ST, Ghoshal KDown-regulation of micro-RNA-1 (miR-1) in lung cancer. Suppression of tumorigenic property of lung cancer cells and their sensitization to doxorubicin-induced apoptosis by miR-1. J Biol Chem 283: 33394-33405[J]. Journal of Biological Chemistry, 2008, 283(48):33394-33405.
[9] Paatero A O , Hilkka T , Happonen L J , et al. Bacteriophage Mu integration in yeast and mammalian genomes[J]. Nucleic Acids Research, 2008, 36(22):e148-e148.
客戶使用本產(chǎn)品發(fā)表的科研文獻(xiàn)（部分）
[1] Zhang D, et al. A non-canonical cGAS-STING-PERK pathway facilitates the translational program critical for senescence and organ fibrosis. Nat Cell Biol. 2022 May;24(5):766-782. doi: 10.1038/s41556-022-00894-z. Epub 2022 May 2. PMID: 35501370.
[2] Lu T, et al. CD73 in small extracellular vesicles derived from HNSCC defines tumour-associated immunosuppression mediated by macrophages in the microenvironment. J Extracell Vesicles. 2022 May;11(5): e12218. doi: 10.1002/jev2.12218. PMID: 35524455; PMCID: PMC9077142.
[3] Chen S, et al. Identification of ubiquitin-specific protease 32 as an oncogene in glioblastoma and the underlying mechanisms. Sci Rep. 2022 Apr 19;12(1):6445. doi: 10.1038/s41598-022-09497-y. PMID: 35440702; PMCID: PMC9018837.
[4] Han L, et al. Uterus globulin associated protein 1 (UGRP1) binds podoplanin (PDPN) to promote a novel inflammation pathway during Streptococcus pneumoniae infection. Clin Transl Med. 2022 Jun;12(6): e850. doi: 10.1002/ctm2.850. PMID: 35652821; PMCID: PMC9161880.
[5] Sun Q, et al. MORTALIN-Ca2+ axis drives innate rituximab resistance in diffuse large B-cell lymphoma. Cancer Lett. 2022 Jul 1; 537:215678. doi: 10.1016/j.canlet.2022.215678. Epub 2022 Apr 18. PMID: 35447282.
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