E.coli宿主細胞RNA殘留檢測試劑盒是用于定量分析檢測各種生物制品的中間品、半成品和成品中殘留的E.coli總RNA含量的試劑盒。

本試劑盒采用探針法熒光定量PCR原理，可專一快速的檢測E.coli細胞殘留的總RNA，定量限低至1 fg/μL水平。該試劑盒可與本公司的磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒(Cat#18461ES/18462ES)及Recombinant DNase I (RNase-free, Yeast) (Cat#14534ES50/14534ES60)配套使用。

 

組分信息

組分編號	組分名稱	41318ES50	41318ES60
41318-A	E.coli qPCR Mix	0.75 mL	1.5 mL
41318-B	One Step Enzyme Mix	200 μL	400 μL
41318-C	RNA Dilution Buffer	1.8 mL×2管	1.8 mL×4管
41318-D	E.coli RNA Control（20 ng/μL）	25 μL	50 μL
41318-E	IC*	50 μL	100 μL

^*IC：Internal control，內(nèi)部對照

 

運輸和儲存條件

1. 所有組分均干冰運輸，-25~-15℃保存，有效期2年。其中，41318-A需避光保存。

2. 收到貨后，請檢查共5個組分是否齊全，并立即放入對應(yīng)的保存溫度中儲存。

 

注意事項

1. 本產(chǎn)品僅作科研用途。

2. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。

3. 使用本試劑前請仔細閱讀說明書，實驗應(yīng)規(guī)范操作，包括樣本處理、反應(yīng)體系的配制及加樣。

4. 每個組分在使用前都應(yīng)充分震蕩混勻，低速離心。

 

適用機型

包含但不限于以下儀器：

Thermo Scientific：ABI 7500，ABI Quant Studio 5；

Bio-Rad：CFX96 Optic Module；

上海宏石醫(yī)療科技：SLAN-96S。

 

使用說明

1. E.coli RNA Control定量參考品的稀釋和標準曲線的制備

用試劑盒中提供的RNA Dilution Buffer（RNA稀釋液）將E.coli RNA Control定量參考品進行梯度稀釋^*，稀釋濃度依次為2 ng/μL、200 pg/μL、20 pg/μL、2 pg/μL、200 fg/μL、20 fg/μL、2 fg/μL。

具體操作如下：

1）將試劑盒中的E.coli RNA Control定量參考品和RNA Dilution Buffer置于冰上融化，待完全融化后，輕微振蕩混勻，低速離心10 sec。

2）取7支潔凈的1.5 mL離心管，分別標記為Std0、Std1、Std2、Std3、Std4、Std5、Std6。

3）在標記為Std0的1.5 mL離心管中加90 μL RNA Dilution Buffer和10 μL E.coli RNA Control定量參考品，Std0即稀釋為2 ng/μL的濃度，振蕩混勻后低速離心10 sec，該濃度可分裝置于-25~-15℃短期保存（不超過3個月）^**，使用時避免反復(fù)凍融。

4）在Std1、Std2、Std3、Std4、Std5、Std6離心管中先分別加入90 μL RNA Dilution Buffer^***，再進行梯度稀釋^****，具體稀釋方法如下：

稀釋管	稀釋比例	終濃度
Std1	10 μL Std0 + 90 μL RNA Dilution Buffer	200 pg/μL
Std2	10 μL Std1 + 90 μL RNA Dilution Buffer	20 pg/μL
Std3	10 μL Std2 + 90 μL RNA Dilution Buffer	2 pg/μL
Std4	10 μL Std3 + 90 μL RNA Dilution Buffer	200 fg/μL
Std5	10 μL Std4 + 90 μL RNA Dilution Buffer	20 fg/μL
Std6	10 μL Std5 + 90 μL RNA Dilution Buffer	2 fg/μL

表1 標準品梯度稀釋

^*每個濃度做3個復(fù)孔，該試劑可測試200 pg/μL~2 fg/μL線性范圍。若需要，可適當擴大或縮小線性范圍。

^**為減少反復(fù)凍融次數(shù)和避免污染，建議初次使用時將RNA定量參考品分裝儲存于-25~-15℃。

^***已融化未使用的RNA稀釋液可保存于2-8℃ 7天，若長時間不用，請放置于-25~-15℃。

^****為確保模板完全混勻，每個梯度稀釋時需輕微震蕩混勻約15 sec。

2. 待測樣本的前處理

1）樣本中殘留RNA的提取純化可采用本公司的磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒(Cat#18461ES/18462ES)。

2）待測樣本在使用E.coli殘留RNA試劑盒做qPCR檢測前，需要進行DNase^*處理，以消除gDNA對qPCR檢測的影響。

3）DNase用量和消化條件需按實際樣品優(yōu)化，可咨詢翌圣生物獲取相關(guān)建議。

^*本試劑盒不含DNase試劑，推薦您購買本公司的Recombinant DNase I (RNase-free, Yeast) (Cat#14534ES50/14534ES60)。14534ES50規(guī)格50U的酶量對應(yīng)E.coli殘留RNA檢測試劑盒41318ES50的50T規(guī)格的用量，同理14534ES60規(guī)格100U的酶量對應(yīng)41318ES60的100T規(guī)格的用量。

3. 樣本加標回收質(zhì)控ERC的制備

根據(jù)需要設(shè)置ERC中的E.coli RNA標準品濃度（以制備加20 pg E.coli RNA量的ERC為例^*），具體操作如下：

1）取100 μL待測樣本加入1.5 mL潔凈的離心管中，再加入10 μL Std3，混勻，標記為ERC。

2）加標回收ERC和同批待測樣本一起進行樣本前處理，制備加標回收ERC純化液。

^*一般建議樣本加標量設(shè)置在樣本中宿主細胞RNA實際殘留量的0.8~1.5倍，如果樣品中RNA殘留量低于定量限，加標量應(yīng)設(shè)置到定量限之內(nèi)，以保證檢測結(jié)果可靠。

4. 陰性抽提質(zhì)控NCS的制備

根據(jù)實驗設(shè)置陰性抽提質(zhì)控NCS，具體操作如下：

1）取100 μL樣本基質(zhì)溶液（或RNA稀釋液）加入1.5 mL潔凈的離心管中，標記為NCS。

2）陰性質(zhì)控NCS和同批待測樣本一起進行樣本前處理，制備成陰性質(zhì)控NCS純化液。

5. 無模板對照NTC的制備

根據(jù)實驗設(shè)置無模板對照NTC，具體操作如下：

1）無模板對照NTC無需進行樣本前處理，在qPCR法檢測殘留RNA含量階段開始配置即可。

2）每管或孔中NTC樣本為20 μL Mix混合液（15 μL E.coli qPCR Mix + 4 μL One Step Enzyme Mix + 1 μL IC）+ 10 μL RNA Dilution Buffer，建議配置3個重復(fù)孔的量。

6. 反應(yīng)體系

組分	體積(μL)
E.coli qPCR Mix*	15
One Step Enzyme Mix	4
IC	1
RNA Template**	10
總體積***	30

表2 標準品反應(yīng)體系

^*根據(jù)反應(yīng)孔數(shù)計算本次所需Mix混合液總量：Mix混合液=（反應(yīng)孔數(shù)+2）× (15+4+1) μL（含有2孔的損失量）。通常，每個樣本做3個重復(fù)孔。

^**反應(yīng)孔數(shù)=（6個濃度梯度的標準曲線+1個無模板對照NTC+1個陰性抽提質(zhì)控NCS+待測樣TS個數(shù)+待測樣本對應(yīng)加標回收ERC個數(shù)）× 3。

NTC (No Template Control)：RNA Dilution Buffer

NCS (Negative Control Solution)：樣本基質(zhì)溶液或RNA Dilution Buffer進行樣本前處理后，所得純化液為NCS

TS (Test Sample)：待測樣本

ERC (Extraction Recovery Control)：待測樣本中加入如10 μL的2 pg/μL標準品RNA后進行樣本前處理，所得純化液為加標回收ERC

^***加樣完成密封好管子后，請低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底，再震蕩混勻5 sec以上，完全混勻反應(yīng)液，再低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底，如有氣泡，需將氣泡排盡。

下表為參考板位：

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

NTC

待測樣本TS1

待測樣本TS1

待測樣本TS1

標準曲線Std1

標準曲線Std1

標準曲線Std1

B

NTC

待測樣本TS2

待測樣本TS2

待測樣本TS2

標準曲線Std2

標準曲線Std2

標準曲線Std2

C

NTC

待測樣本TS3

待測樣本TS3

待測樣本TS3

標準曲線Std3

標準曲線Std3

標準曲線Std3

D

標準曲線Std4

標準曲線Std4

標準曲線Std4

E

NCS

樣本加標ERC1

樣本加標ERC1

樣本加標ERC1

標準曲線Std5

標準曲線Std5

標準曲線Std5

F

NCS

樣本加標ERC2

樣本加標ERC2

樣本加標ERC2

標準曲線Std6

標準曲線Std6

標準曲線Std6

G

NCS

樣本加標ERC3

樣本加標ERC3

樣本加標ERC3

H

表3 上機參考板位

該示例是對E.coli殘留RNA qPCR法檢測操作的展示，檢測樣本包括：6個濃度梯度的E.coli RNA標準曲線、1個無模板對照NTC、1個陰性質(zhì)控NCS、3個待測樣本TS、3個加樣回收ERC。建議每個樣本做3個重復(fù)孔。

7. 擴增程序參數(shù)設(shè)置（兩步法）（以ABI公司7500 qPCR儀、軟件版本2.0為例）

1）創(chuàng)建空白新程序，選擇絕對定量檢測模板。

2）創(chuàng)建2個檢測探針，Target 1命名為“E.coli-RNA”，選擇報告熒光基團為“FAM”，猝滅熒光基團為“None”；

Target 2命名為“IC”，選擇報告熒光基團為“VIC”，猝滅熒光基團為“None”。參比熒光為“ROX”（參比熒光可根據(jù)儀器型號等情況，選擇是否需要添加）。

3）在“Assign target (s) to the selected wells”面板中，將標準曲線孔的“Task”一欄設(shè)置為“Standard”，并且在“Quantity”一欄分別賦值為“200000”、“20000”、“2000”、“200”、“20”、“2”（含義為每孔RNA濃度，單位為fg/μL），并且在相應(yīng)的“Sample Name”一欄命名為“200 pg/μL”、“20 pg/μL”、“2 pg/μL”、“200 fg/μL”、“20 fg/μL”、“2 fg/μL”；將無模板對照NTC孔的“Task”一欄設(shè)置為“NTC”；將陰性質(zhì)控NCS孔、待測樣本TS孔、樣本加標回收ERC孔的“Task”一欄設(shè)置為“Unknown”，并且在相應(yīng)的“Sample Name”一欄中分別命名為“NCS”、“TS”、“ERC”，參比熒光勾選“ROX”，之后點擊“Start Run”，開始儀器運行。

4）擴增程序設(shè)置：設(shè)置三步法擴增程序，反應(yīng)體積30 μL。

循環(huán)步驟	溫度（℃）	時間	循環(huán)數(shù)
逆轉(zhuǎn)錄	50℃	20 min	1
預(yù)變性	95℃	5 min	1
變性	95℃	15 sec	40
退火/延伸（收集熒光）	60℃	30 sec

表4 擴增程序

8. qPCR結(jié)果分析

1）在“Analysis”的“Amplification Plot”面板中，系統(tǒng)會自動給出“Threshold”，有時系統(tǒng)給出的“Threshold”離基線太近，導(dǎo)致復(fù)孔之間Ct相差甚遠，可手動調(diào)節(jié)“Threshold”至合適位置，點擊“Analyze”。此時可在“Multicomponent Plot”初步查看擴增曲線的形態(tài)是否正常。

2）在“Analysis”的“Standard Curve”面板中，可讀取標準曲線的R²、擴增效率（Eff%）、斜率（Slope）、截距（Intercept）等。正常的標曲：R²＞0.99，擴增效率在90%≤Eff%≤110%范圍內(nèi)，Slope在-3.6~-3.1。

3）在“Analysis”的“View well table”面板中，“Quantity”一欄可讀取無模板對照NTC、陰性質(zhì)控NCS、待測樣本TS、樣本加標回收ERC的檢測值，單位為fg/μL，后續(xù)可在檢測報告中將單位換算成pg/μL或pg/mL。

4）結(jié)果分析的參數(shù)設(shè)置需依據(jù)具體的機型及使用的軟件版本，一般也可由儀器自動判讀。

5）根據(jù)待測樣本TS和樣本加標回收ERC的檢測結(jié)果計算加標回收率，加標回收率要求在50%～150%之間。加標回收率計算公式：回收率(%) = {樣本加標測定值(eg.pg/µL)-樣本測定值(eg.pg/µL)}×洗脫體積(eg.µL) / RNA加入量理論值(eg.pg)×100%。

6）陰性質(zhì)控NCS的Ct值應(yīng)大于標曲最低濃度Ct的均值。

7）無模板對照NTC的檢測結(jié)果應(yīng)為Undetermined或Ct值≥32。

8）待測樣本的Ct-IC值應(yīng)該與NTC的Ct-IC值一致或±1，如果待測樣本的Ct-IC值與NTC的Ct-IC值相比明顯增大，則表明樣本可能存在明顯抑制。如果同時測試加標樣本，則優(yōu)先考慮樣本加標回收率結(jié)果，IC結(jié)果作為參考。

Ver.CN20230830