CelCulSF^TM 293 Cell Culture Medium（Serum-free）培養(yǎng)基為無動物源、無蛋白的完全化學(xué)成分限定培養(yǎng)基。適應(yīng)于HEK293各細胞系細胞（如HEK293F，HEK293T，HEK293H，Expi293 等）規(guī)模化無血清懸浮培養(yǎng)及后續(xù)轉(zhuǎn)染表達。產(chǎn)品經(jīng)過定向優(yōu)化，尤其適應(yīng)于AAV及蛋白等相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)和生產(chǎn)過程，可支持細胞高密度擴增及穩(wěn)定的產(chǎn)物表達。對HEK293各細胞類型具有廣泛的適應(yīng)性。為了適應(yīng)不同培養(yǎng)體系及生產(chǎn)工藝，配套培養(yǎng)基產(chǎn)品提供對應(yīng)補料，同時也可匹配其他商業(yè)化補料產(chǎn)品。

 

運輸與保存方法

冰袋運輸。2～8℃，避光保存，有效期1年。

 

使用方法

一、標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)

參數(shù)	設(shè)定值
50mL TPP 管	培養(yǎng)體積： 10-20 mL
125~1000mL 搖瓶	培養(yǎng)體積： 搖瓶總體積的 20~30%
搖床轉(zhuǎn)速	TPP：轉(zhuǎn)速 220Rpm,  搖瓶 110-130 Rpm
搖床振幅	50mm
培養(yǎng)基	CelCulSFTM 293 Cell Culture Medium（Serum-free）
接種密度	0.5×106 cells/mL
培養(yǎng)溫度	37℃
CO2%	5%
相對濕度	80%RH

二、培養(yǎng)基的適應(yīng)

通常，在原用培養(yǎng)基中生長的HEK293細胞需要轉(zhuǎn)移到由50%原用培養(yǎng)基和50%培養(yǎng)（CelCulSF^TM 293 Cell Culture Medium）組成的新培養(yǎng)基中進行適應(yīng)性生長。

1. 細胞傳代當(dāng)天，取0.5mL細胞懸液，用細胞計數(shù)儀分析活細胞密度（×10⁶細胞/mL）和細胞活率（%）。將原用培養(yǎng)基中生長的細胞移入新培養(yǎng)基*（50%CelCulSFTM 293 Cell Culture Medium+ 50%原用培養(yǎng)基），接種密度為0.5×10⁶/mL，傳代后按照規(guī)定的環(huán)境條件培養(yǎng)細胞。

2. 細胞培養(yǎng)至48±3小時后，建議按此方法進行至少3次細胞適應(yīng)性傳代。當(dāng)細胞活率高于90%時轉(zhuǎn)入100% CelCulSF^TM 293 Cell Culture Medium培養(yǎng)基培養(yǎng)。

三、 細胞傳代和擴增

1. 37℃水浴中預(yù)熱CelCulSF^TM 293 Cell Culture Medium 培養(yǎng)基。

2. 使用75%酒精清潔/消毒生物安全柜。

3. 使用75%酒精噴灑培養(yǎng)基瓶，并置于生物安全柜。

4. 從培養(yǎng)箱中取出搖瓶（或TPP管），噴灑75%酒精并置于生物安全柜。

5. 接種密度為1.0×10⁶ viable cells/mL。培養(yǎng)48±3小時后，取0.5mL細胞懸液，用細胞計數(shù)儀分析活細胞密度（×10⁶細胞/mL）和活細胞（%）。

6. 傳代前，如果細胞密度低于2.0 ×10⁶/mL，或細胞活率低于80%，需要150g - 300g（大約800 rpm~1200 rpm）離心5分鐘處理細胞。輕輕棄上清，使用100%新鮮培養(yǎng)基按0 .5×10⁶/mL重懸細胞，并將細胞接種至新?lián)u瓶（或TPP管），傳代后按照規(guī)定的環(huán)境條件培養(yǎng)細胞。

7. 如果傳代前細胞密度大于2.0×10⁶/mL且活細胞率高于85%，則將適量的細胞懸液轉(zhuǎn)移到新?lián)u瓶（或TPP管）中，并用新鮮培養(yǎng)基直接調(diào)整最終培養(yǎng)體積進行細胞傳代，然后在規(guī)定的環(huán)境條件下培養(yǎng)細胞。

如果傳代比（傳代后的種子密度：傳代前的細胞密度）大于1:4，細胞需要離心并重新懸浮在100%新鮮培養(yǎng)基中。

四、細胞凍存

1. 細胞冷凍前，將含新鮮異丙醇的程序降溫盒、凍存管等所需材料置于4℃冰箱中，預(yù)冷至少24小時后冷凍保存，或在-20℃下放置2小時~4小時后冷凍保存。

2 取樣計數(shù)，檢測分析活細胞密度（×10⁶細胞/mL）和細胞活率（%）

注：凍存培養(yǎng)基 ：20% DMSO+80% CelCulSF^TM 293 Cell Culture Medium

3 根據(jù)凍存細胞的數(shù)量、凍存體積和凍存密度（建議凍存密度為10 - 20×10⁶ /mL/支），

計算所需的細胞量，并移入離心管中，以800 rpm - 1500 rpm（即150 g - 300 g）離心5min。

4 棄上清液，拍打離心管底部使細胞均勻分散，加入凍存體積一半的生長培養(yǎng)基，輕輕吹打細胞，形成均勻的細胞懸液，見下表（示例及根據(jù)傳代數(shù)據(jù)選擇哪種培養(yǎng)基）：

培養(yǎng)基	成分	體積	終培養(yǎng)基
凍存培養(yǎng)基	20% DMSO+80% CelCulSFTM 293 Cell Culture Medium	10mL	10% DMSO+90% CelCulSFTM 293 Cell Culture Medium
生長培養(yǎng)基	CelCulSFTM 293 Cell Culture Medium	10mL

用無菌移液管轉(zhuǎn)移相同體積的凍存培養(yǎng)基（含20% DMSO），逐滴加入細胞懸液中。加入凍存培養(yǎng)基時，輕輕搖動離心管，保持細胞密度均勻；

5 用一次性無菌移液管將1mL - 1.5mL細胞凍懸液移入預(yù)冷凍存管中，置于冰上保存；

6  凍存細胞懸液在分裝過程中需要反復(fù)混合。分裝完成后，將凍存管轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的程序降溫盒中，在-80℃冰箱中至少保存24小時；

7  轉(zhuǎn)移至液氮罐中繼續(xù)保存。

五、細胞復(fù)蘇

1  D0復(fù)蘇細胞

2  使用75%酒精清潔/消毒生物安全柜。

3  37℃水浴中預(yù)熱CelCulSF^TM 293 Cell Culture Medium 培養(yǎng)基；

4  使用75%酒精噴灑培養(yǎng)基瓶，并置于生物安全柜；

5  從液氮罐中取出凍存管，并置于干冰上；

6  復(fù)蘇1支細胞，并在37℃水浴中，輕輕晃動凍存管，解凍1分鐘；

7 用75%酒精噴灑凍存管外壁；

8  用無菌移液管將凍存管中的細胞輕輕移到含有30 mL預(yù)熱培養(yǎng)基（CelCulSF^TM 293 Cell Culture Medium）的離心管中。如有必要，使用預(yù)熱的培養(yǎng)基（CelCulSF^TM 293 Cell Culture Medium）沖洗凍存管中的細胞；

9  150g - 300g（約800rpm - 1200rpm）離心5分鐘，丟棄上清液并將細胞重懸于10 ~ 30mL新鮮預(yù)熱培養(yǎng)基（CelCulSF^TM 293 Cell Culture Medium）中，然后使用預(yù)熱培養(yǎng)基（CelCulSF^TM 293 Cell Culture Medium）在搖瓶中將細胞密度調(diào)節(jié)至0.5×10⁶cells/mL；

10 取0.5mL細胞懸液，用細胞計數(shù)儀分析活細胞密度（×10⁶/mL）和細胞活率（%）。

11 如果細胞活率＞85%，將細胞置于規(guī)定的環(huán)境條件下培養(yǎng)細胞

12 傳代、擴大培養(yǎng)細胞。

6、蛋白表達，腺相關(guān)病毒病毒等在懸浮293細胞（293F、293T、293H、Expi293）上的表達

1  細胞在CelCulSF^TM 293 Cell Culture Medium中培養(yǎng)；

2  72±3 小時后，取 0.5mL 細胞懸液，用細胞計數(shù)儀分析活細胞密度（×10⁶/mL）和細胞活率（%）；

3  用相同體積的預(yù)熱 CelCulSF^TM 293 Cell Culture Medium 培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)物（培養(yǎng)物體積：待添加的CelCulSF^TM 293 Cell Culture Medium 培養(yǎng)基體積=1:1）；

4  根據(jù)病毒培養(yǎng)工藝，接種病毒，并繼續(xù)培養(yǎng)病毒至收獲。可根據(jù)實際生產(chǎn)工藝進行優(yōu)化或聯(lián)系產(chǎn)品相關(guān)負責(zé)人。

 

注意事項

1. 細胞應(yīng)及時傳代。如果細胞密度很高，會導(dǎo)致細胞狀態(tài)下降，死亡細胞增多，細胞碎片增多，細胞聚集；

2. 液體細胞培養(yǎng)基不宜長時間光照或熱照，應(yīng)避光保存在2～8℃。

3. 液體培養(yǎng)基中含有6mM  L-谷氨酰胺，長期未使用建議使用前添加2-3mM  L-谷氨酰胺。

HB230321