CelCulSF^TM Insect Cell Culture Medium（Serum-free）培養(yǎng)基是無(wú)血清培養(yǎng)基，無(wú)血清無(wú)蛋白，不含任何動(dòng)物源成分。適應(yīng)于昆蟲(chóng)細(xì)胞（Sf 9、High Five等）懸浮馴化及規(guī)?；療o(wú)血清懸浮培養(yǎng)，支持昆蟲(chóng)細(xì)胞快速高密度擴(kuò)增及高效表達(dá)蛋白產(chǎn)品。 可用于新冠疫苗、VLP 等產(chǎn)品研發(fā)和生產(chǎn)過(guò)程，支持從研發(fā)至規(guī)模化生產(chǎn)。

 

運(yùn)輸與保存方法

冰袋運(yùn)輸。2～8℃，避光保存，有效期1年。

 

使用方法

一、標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)

參數(shù)	設(shè)定值
50mL TPP 管	培養(yǎng)體積： 10-20 mL
125~1000mL 搖瓶	培養(yǎng)體積： 搖瓶總體積的 20~30%
搖床轉(zhuǎn)速	TPP：轉(zhuǎn)速 220Rpm,  搖瓶 110-130 Rpm
搖床振幅	50mm
培養(yǎng)基	CelCulSFTM Insect Cell Culture Medium（Serum-free）
接種密度	1.0×106 cells/mL
培養(yǎng)溫度	27℃
CO2%	Atmosphere
相對(duì)濕度	80%

二、培養(yǎng)基的適應(yīng)

通常，在原用培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的昆蟲(chóng)細(xì)胞可直接離心換液為本培養(yǎng)基。特殊情況下，可嘗試轉(zhuǎn)移到由50%原用培養(yǎng)基和50% CelCulSF^TM Insect Cell Culture Medium組成的新培養(yǎng)基中進(jìn)行適應(yīng)性生長(zhǎng)。

1. 細(xì)胞傳代當(dāng)天，取0.5mL細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分析活細(xì)胞密度（×10⁶細(xì)胞/mL）和細(xì)胞活率（%）。將原用培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞移入新培養(yǎng)基*（50% CelCulSF^TM Insect Cell Culture Medium + 50%原用培養(yǎng)基），接種密度為1.0×10⁶/mL，傳代后按照規(guī)定的環(huán)境條件培養(yǎng)細(xì)胞。

2. 細(xì)胞培養(yǎng)至48±3小時(shí)后，重復(fù)1.2.1步驟，建議按此方法進(jìn)行至少3次細(xì)胞適應(yīng)性傳代。當(dāng)細(xì)胞活率高于90%時(shí)轉(zhuǎn)入100% CelCulSF^TM Insect Cell Culture Medium培養(yǎng)基培養(yǎng)。

三、 細(xì)胞傳代和擴(kuò)增

1. 27℃水浴中預(yù)熱CelCulSF^TM Insect Cell Culture Medium 培養(yǎng)基。

2. 使用75%酒精清潔/消毒生物安全柜。

3. 使用75%酒精噴灑培養(yǎng)基瓶，并置于生物安全柜。

4. 從培養(yǎng)箱中取出搖瓶（或TPP管），噴灑75%酒精并置于生物安全柜。

5. 接種密度為1.0×10⁶ viable cells/mL。培養(yǎng)48±3小時(shí)后，取0.5mL細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分析活細(xì)胞密度（×10⁶細(xì)胞/mL）和活細(xì)胞（%）。

6. 傳代前，如果Sf9細(xì)胞密度低于2.5E6 cells/mL（High five細(xì)胞密度低于4.0E6 cells/mL），或細(xì)胞活率低于90%，需要170g - 190g（大約800 rpm-1000 rpm）離心5分鐘處理細(xì)胞。輕輕棄上清，使用100%新鮮培養(yǎng)基按1.0 ×10⁶/mL重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞接種至新?lián)u瓶（或TPP管），傳代后按照規(guī)定的環(huán)境條件培養(yǎng)細(xì)胞（見(jiàn)第1.1節(jié)）。

7. 如果傳代前Sf9細(xì)胞密度高于2.5E6 cells/mL（High five細(xì)胞密度高于4.0E6 cells/mL）且活細(xì)胞率高于90%，則將適量細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到新?lián)u瓶（或TPP管）中，并用新鮮培養(yǎng)基直接調(diào)整最終培養(yǎng)體積進(jìn)行細(xì)胞傳代，然后在規(guī)定的環(huán)境條件下培養(yǎng)細(xì)胞（見(jiàn)第1.1節(jié)）。

如果傳代比（傳代后的種子密度：傳代前的細(xì)胞密度）大于1:2.5（Sf9）或大于1:4（High five），細(xì)胞需要離心并重新懸浮在100%新鮮培養(yǎng)基中。

四、細(xì)胞凍存

1. 細(xì)胞冷凍前，將含新鮮異丙醇的程序降溫盒、凍存管等所需材料置于4℃冰箱中，預(yù)冷至少24小時(shí)后冷凍保存，或在-20℃下放置2小時(shí)~4小時(shí)后冷凍保存。

2. 根據(jù)凍存細(xì)胞的數(shù)量、凍存體積和凍存密度（建議凍存密度為25-35×10⁶ /mL/支），計(jì)算所需的細(xì)胞量，并移入離心管中，以800rpm-1000rpm（即170g-190g）離心5min。

3. 去除剩余上清液，拍打離心管底部使細(xì)胞均勻分散，加入細(xì)胞冷凍液，輕輕吹打細(xì)胞，形成均勻的細(xì)胞懸液。

4 用一次性無(wú)菌移液管將1mL細(xì)胞凍懸液移入預(yù)冷凍存管中，置于冰上保存；

5. 離心管中的細(xì)胞懸液在分裝過(guò)程中需要反復(fù)混合。分裝完成后，將凍存管轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的程序降溫盒中，在-80℃冰箱中至少保存24小時(shí)；

6. 轉(zhuǎn)移至液氮罐中繼續(xù)保存。

五、 細(xì)胞復(fù)蘇

1. Day 0時(shí)復(fù)蘇細(xì)胞

2. 使用75%酒精清潔/消毒生物安全柜。

3. 27℃水浴中預(yù)熱CelCulSF^TM Insect Cell Culture Medium培養(yǎng)基；

4. 使用75%酒精噴灑培養(yǎng)基瓶，并置于生物安全柜；

5. 從液氮罐中取出凍存管，并置于干冰上；

6. 復(fù)蘇1支細(xì)胞，并在37℃水浴中，輕輕晃動(dòng)凍存管，解凍約1-2分鐘；

7. 用75%酒精噴灑凍存管外壁；

8. 用無(wú)菌移液管將凍存管中的細(xì)胞輕輕移到含有10mL預(yù)熱培養(yǎng)基（CelCulSF^TM Insect Cell Culture Medium）的離心管中。如有必要，使用預(yù)熱的培養(yǎng)基（CelCulSF^TM Insect Cell Culture Medium）沖洗凍存管中的細(xì)胞；

9. 170g-190g（約800rpm-1000rpm）離心5分鐘，丟棄上清液并將細(xì)胞重懸于10mL新鮮預(yù)熱培養(yǎng)基（CelCulSF^TM Insect Cell Culture Medium）中。

10. 取0.5mL細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分析活細(xì)胞密度（×10⁶/mL）和細(xì)胞活率（%）。

11. 然后使用預(yù)熱培養(yǎng)基（CelCulSF^TM Insect Cell Culture Medium）將細(xì)胞密度調(diào)節(jié)至1.0×10⁶cells/mL，轉(zhuǎn)移至搖瓶（或TPP）中并將細(xì)胞置于規(guī)定的環(huán)境條件下培養(yǎng)細(xì)胞（見(jiàn)第1.1節(jié)）。

12. 48±3 小時(shí)后，傳代、擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞。

注：如果細(xì)胞活率＜85%，需要170g-190g（大約800rpm~1000rpm）離心5分鐘處理細(xì)胞。棄上清，使用100%新鮮培養(yǎng)基按1.0 ×10⁶/mL重懸細(xì)胞，置于規(guī)定的環(huán)境條件下培養(yǎng)細(xì)胞。

六、懸浮昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)蛋白

1. 細(xì)胞在CelCulSF^TM Insect Cell Culture Medium 中培養(yǎng)，穩(wěn)定傳代3代后可進(jìn)行病毒感染；

2. 按1.0×10⁶cells/mL接種，72±3 小時(shí)后，取 0.5mL 細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分析活細(xì)胞密度（×10⁶/mL）和細(xì)胞活率（%）；

3. 用相同體積的預(yù)熱 CelCulSF^TM Insect Cell Culture Medium 培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)物（培養(yǎng)物體積：待添加的CelCulSF^TM Insect Cell Culture Medium 培養(yǎng)基體積=1:1）；

4. 根據(jù)病毒培養(yǎng)工藝，接種病毒，并繼續(xù)培養(yǎng)病毒至收獲。

 

注意事項(xiàng)

1.細(xì)胞應(yīng)及時(shí)傳代。如果細(xì)胞密度很高，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)下降，死亡細(xì)胞增多，細(xì)胞碎片增多，細(xì)胞聚集；

2.液體細(xì)胞培養(yǎng)基不宜長(zhǎng)時(shí)間光照或熱照，應(yīng)避光保存在2～8℃。

HB230113