鈣離子檢測(cè)熒光探針專題
鈣離子濃度變化是活細(xì)胞接受外界刺激后產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)的重要信息傳遞方式，因此細(xì)胞內(nèi)鈣離子檢測(cè)是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）介導(dǎo)的相關(guān)藥物篩選以及其他相關(guān)實(shí)驗(yàn)中非常重要的一種研究手段，該領(lǐng)域中常使用鈣離子熒光探針與鈣離子的特異性結(jié)合來觀察細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度水平的變化，此類探針未結(jié)合Ca2+前幾乎無熒光，結(jié)合Ca2+后，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，所顯示光譜可被熒光顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、熒光光譜法以及熒光酶標(biāo)儀等多種方法檢測(cè)。
常用的Ca2+熒光探針根據(jù)波長(zhǎng)的不同，分為兩大類：
第一類：可見光激發(fā)Ca2+熒光探針
與紫外光激發(fā)的熒光探針相比，如Fura-2和Indo-1，可見光激發(fā)Ca2+探針具有以下特點(diǎn)：
1）適用于大多數(shù)的激光共聚焦測(cè)鈣系統(tǒng)，包括共聚焦激發(fā)掃描顯微鏡以及流式細(xì)胞儀等。
2）具有更強(qiáng)的染料吸收性能，使得更低濃度的探針即可成功檢測(cè)Ca2+變化，從而降低了對(duì)活細(xì)胞的光毒性。
3）Ca2+依賴性熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，對(duì)Ca2+變化水平檢測(cè)敏感度更高。
4）降低樣品自熒光以及光散射的干擾。
5）兼容光激活探針以及UV-激發(fā)試劑，因此更方便于多參數(shù)檢測(cè)。5）無光譜偏移。
介紹幾種受歡迎的可見光激發(fā)Ca2+熒光探針：
1）Fluo-3
Fluo-3是常用的可見光激發(fā)Ca2+熒光探針，較高的Ca2+結(jié)合力可捕捉細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)的動(dòng)力學(xué)變化，使用于多種流式細(xì)胞術(shù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)，如籠鎖Ca2+螯合劑光活化、第二信使、神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)研究以及細(xì)胞水平的藥物篩選等。Fluo-3游離配體幾乎是非熒光性的，其熒光不會(huì)隨鈣離子濃度升高而增強(qiáng)。但是，當(dāng)它與細(xì)胞內(nèi)鈣離子結(jié)合后可以產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光，熒光會(huì)增加60至100倍，最大激發(fā)波長(zhǎng)為 506nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為 526nm。實(shí)際檢測(cè)時(shí)推薦使用的激發(fā)波長(zhǎng)為488nm左右，發(fā)射波長(zhǎng)為525～530nm。可以使用激光共聚焦顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。
2）Fluo-4
Fluo-4是鈣指示劑Fluo-3的升級(jí)版本，主要變化為后者分子上的兩個(gè)氯原子被Fluo-4上的氟所取代，該結(jié)構(gòu)上的微小變化使Fluo-4,AM加載更快，在相同濃度下檢測(cè)信號(hào)更強(qiáng)。
3）Rhod-2
Rhod-2是另一種可見光激發(fā)的高親和力Ca2+指示劑，與其他可見光激發(fā)熒光探針如Fluo-3/4相比，Rhod-2具有長(zhǎng)波長(zhǎng)，更適用于檢測(cè)具有較高自熒光現(xiàn)象的細(xì)胞和組織內(nèi)鈣離子水平以及檢測(cè)由光感受器和籠鎖Ca2+螯合劑光激活導(dǎo)致的鈣離子釋放。
圖 Fluorescence emission spectra at equal concentrations of fluo-4 (blue) and fluo-3 (red) in solutions containing 0–39.8 µM free Ca2+.
你所不知道的秘密：為什么許多熒光探針會(huì)有R-AM或者R的形式提供？以Fluo-4或Fluo-4, AM為例。
常規(guī)的熒光探針如Fluo-4屬極性大的酸性化合物，無法進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。此時(shí)，若想做細(xì)胞內(nèi)染色，需要通過膜片微電極（patch pipette），顯微注射（microinjection），胞引作用加載試劑等手段，輔助實(shí)現(xiàn)藥物加載，何其麻煩??！
為此，而通過在Fluo-4的負(fù)性基團(tuán)上結(jié)合乙酰氧甲酯（AM），該單一的變化既增加了酯溶性又消除了負(fù)電荷，極大的提高了細(xì)胞滲透性。只需要把細(xì)胞孵育在含藥物的培養(yǎng)液中，即可實(shí)現(xiàn)加載，非常省事。而一旦Fluo-4 AM進(jìn)入細(xì)胞后，酯化鈣離子熒光探針被酯酶水解，恢復(fù)Fluo-4，在胞內(nèi)完全發(fā)揮其正常生理功能。
產(chǎn)品信息
|
產(chǎn)品定位 |
產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品貨號(hào) |
規(guī)格 |
|
可見光激發(fā) |
40776ES50/72/80 |
50μg/5×50μg/1mg |
|
|
40703ES50/72/80 |
50μg/5×50μg/1mg |
||
|
40704ES50/72/80 |
50μg/5×50μg/1mg |
第二類：紫外光激發(fā)Ca2+熒光探針
Fura-2和Indo-1均屬可見光激發(fā)Ca2+熒光指示劑，也是目前常用的比率測(cè)量熒光探針。與第一代染料Quin-2相比，F(xiàn)ura-2和Indo-1發(fā)出更強(qiáng)的熒光，在生理pH范圍內(nèi)對(duì)pH變化不敏感。與Mg2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+等二價(jià)金屬離子相比，對(duì)Ca2+有更高的選擇性，因此得到了廣泛應(yīng)用，同時(shí)作為雙波長(zhǎng)熒光染料在標(biāo)定Ca2+濃度時(shí)不再單純依靠熒光強(qiáng)度的變化。
1）Fura-2
2）Indo-1
Fura-2是雙激發(fā)波長(zhǎng)熒光染料，Indo-1是雙發(fā)射波長(zhǎng)熒光染料，均采用比率測(cè)量方法，該方法可以消除不同細(xì)胞樣品間熒光探針裝載效率的差異，熒光探針的滲漏，細(xì)胞厚度差異等一些誤差因素。Fura-2特別適合于數(shù)字成像顯微鏡，使用該設(shè)備可更方便的調(diào)整激發(fā)波長(zhǎng)，使探針結(jié)合鈣離子后在300-400nm的激發(fā)波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描Fura-2的吸收偏移，在510nm處檢測(cè)發(fā)射波長(zhǎng)。相比之下，Indo-1更傾向于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，使用該設(shè)備可實(shí)現(xiàn)在氬離子激光器的351-364光譜范圍內(nèi)單一波長(zhǎng)的激發(fā)，在400nm和480nm的波長(zhǎng)處分別檢測(cè)結(jié)合鈣離子和未結(jié)合鈣離子的熒光信號(hào)，通過二者的比值確定鈣離子的濃度。Fura-2,AM和Indo-1,AM分別是Fura-2和Indo-1的乙酰氧甲酯（AM）衍生物，具有活細(xì)膜滲透性。
產(chǎn)品信息
|
產(chǎn)品定位 |
產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品貨號(hào) |
規(guī)格 |
|
紫外光激發(fā) |
40775ES50/72/80 |
50μg/5×50μg/1mg |
|
|
40702ES50/72/80 |
50μg/5×50μg/1mg |
這些相關(guān)試劑，也常用在鈣離子研究中，你知道嗎？
|
產(chǎn)品名稱 |
貨號(hào) |
規(guī)格 |
功能 |
|
60318ES60 |
100mg |
探針加載增強(qiáng)劑 |
|
|
60313ES60 |
100ml |
粉末類鈣離子探針的溶劑 |
|
|
50401ES03 |
1mg |
鈣離子載體 |
|
|
50402ES03 |
1mg |
鈣離子載體 |
|
|
50403ES03 |
1ml |
鈣離子載體 |
|
|
60339ES10 |
10g |
鈣選擇性螯合劑 |
