分子克隆，一個大家做實驗必經的實驗流程。我們可以通過分子克隆將所需的目的基因連接到載體上，最后導入表達系統(tǒng)中進行表達。分子克隆包含：目的基因擴增、載體線性化、連接以及轉化篩選。說到載體線性化，除了PCR線性化載體，大多數小伙伴會選擇酶切進行載體線性化。對于一些單酶切位點的線性化載體，我們常常需要堿性磷酸酶進行載體去磷酸化。

堿性磷酸酶，可以將DNA、RNA的5’端磷酸基團去除，常用于阻止載體的自連作用，也可用于酶法化學發(fā)光。在分子克隆實驗中，DNA連接酶催化DNA連接時需要有磷酸基團的存在，載體在經酶切后會在切點端保留一個磷酸基團。而載體經堿性磷酸酶去磷酸化后因5’端無磷酸基團，因而不可以和自身3’-端連接。因此連接反應中載體本身會優(yōu)先發(fā)生的連接反應被阻止，提高了目的片段插入率。在我們使用完堿性磷酸酶之后，載體的5’端磷酸基團被去掉，載體自身在普通的連接酶作用下不能進行連接；但載體和片段之間形成3´,5´-磷酸二酯鍵，連接雙鏈其中的一條，另一條鏈則靠大腸桿菌自身的修復系統(tǒng)進行連接。

小牛腸堿性磷酸酶（CIAP）和蝦堿性磷酸酶（SAP）都可以去除載體或片段的5’-末端磷酸基團，但失活方法不同。

小牛腸堿性磷酸酶，在底物濃度高時，CIAP的最適pH約為10；底物濃度低時，最適pH約為8，但特異性比高底物濃度時低。同時，其在保存條件下極其穩(wěn)定，但在螯合劑存在條件下，經65℃、30分鐘加熱處理99%的活性不可逆失活。失活處理時，建議試用苯酚，從而使酶完全失活。

蝦堿性磷酸酶，可以在65℃ 加熱 5 分鐘的條件下不可逆失活。同時，在進行去磷酸化反應之后，不需要純化產物，可直接用于后續(xù)的連接反應。蝦堿性磷酸酶也可以用來降解PCR反應中的游離dNTP，用于制備測序模板和 SNP 分析。同樣無需純化，可直接用于下游實驗。

載體線性化后，去磷酸化檢測：在我們對線性化的載體使用了堿性磷酸酶進行去磷酸化之后，可以直接將酶切后的載體加上T4 DNA連接酶進行酶連，然后進行轉化涂平板并計算菌落數。將酶切后的載體直接進行轉化涂平板并計算菌落數。比較沒有經過酶連以及經過酶連的兩個平板的菌落差異。若兩次實驗的差異不大那么就證明去磷酸化效率高。

除了兩種堿性磷酸酶，翌圣生物還有更多的克隆及克隆篩選相關試劑供您選擇。

點擊產品名稱查看詳情