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新升級產(chǎn)品10923ES重磅來襲！
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Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit是新一代的同源重組克隆試劑盒，精心優(yōu)化的2×Hieff Clone® Universal Enzyme Premix預(yù)混了重組酶和重組反應(yīng)所需緩沖液，并添加了獨特的重組增強因子，可顯著提高重組克隆效率。
該試劑盒可以將PCR產(chǎn)物定向克隆至任何載體的任何位點，濃度可低至5 ng/μL，一次可實現(xiàn)多至6個片段的順序拼接克隆。將載體線性化，并在插入片段正、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5’和3’末端分別帶有與線性化載體兩末端對應(yīng)的完全一致的序列。PCR產(chǎn)物和線性化載體在重組酶的作用下，僅需50℃，5-15 min即可完成重組反應(yīng)。克隆陽性率可達95%以上。
產(chǎn)品組分
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組分編號 |
組分名稱 |
產(chǎn)品規(guī)格 |
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10922ES08 (5 T) |
10922ES20 (20 T) |
10922ES50 (50 T) |
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10922-A |
2×Hieff Clone® Universal Enzyme Premix |
50 μL |
200 μL |
500 μL |
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10922-B |
500 bp Control Insert (25 ng/μL) |
5 μL |
5 μL |
5 μL |
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10922-C |
pUC 19 Control Vector, linearized (50 ng/μL) |
5 μL |
5 μL |
5 μL |
產(chǎn)品應(yīng)用
快速克?。欢ㄏ蚩寺。欢c突變。
運輸與保存方式
冰袋運輸。-20℃保存，有效期1年。
注意事項
1. 需自備的材料：
1）自備樣品：自備好線性化載體和插入片段。
2）自備試劑（僅羅列部分）：
① 超級感受態(tài)：轉(zhuǎn)化效率＞108 cfu/μg，如翌圣DH5α超級感受態(tài)細胞（Cat#11802）；
② 高保真酶： 2×Hieff Canace® Gold PCR Master Mix（Cat#10149）或其他等效產(chǎn)品；
③ 菌落PCR mix：2×Hieff® Robust PCR Master Mix（With Dye)（Cat#10106）或其他等效產(chǎn)品；
④ 核酸染料：YeaRed Nucleic Acid Gel Stain (10,000 × in Water)（Cat#10202）或其他等效產(chǎn)品；
3）自備儀器耗材（僅羅列部分）：PCR儀，水平電泳槽，切膠儀，EP管等；
2. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。
3. 本產(chǎn)品僅作科研用途！
簡版操作步驟
一、重組反應(yīng)
1.線性化載體與插入片段使用量
Hieff Clone® 重組反應(yīng)體系最適片段及載體插入總量為0.02-1 pmol，1-3片段為0.02-0.5 pmol，4-6片段為0.5-1 pmol。最適載體與插入片段摩爾比為1:3。對應(yīng)的DNA質(zhì)量可由以下公式計算獲得：
線性化載體使用量ng =（線性化載體堿基對數(shù)×0.65×總pmol）/ （1＋3n）
插入片段使用量ng =（插入片段堿基對數(shù)×0.65×總pmol×3）/ （1＋3n）
其中n表示插入片段數(shù)目。
線性化載體使用體積 = 線性化載體使用量ng / 線性化載體濃度ng/μL
插入片段使用體積 = 插入片段使用量ng /插入片段濃度ng/μL
【注】：當插入片段長度大于載體時，最適載體與插入片段使用量的計算方式應(yīng)互換，即插入片段當做載體，載體當做插入片段進行計算。線性化載體及插入片段的使用量最低可達到5 ng。線性化載體和插入片段擴增產(chǎn)物未純化，直接使用時，使用總體積應(yīng)不超過反應(yīng)體系體積的1/5，如20 μL體系不超過4 μL。
2.重組反應(yīng)體系（推薦冰上配制，各組分使用前需混勻）
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組分 |
重組反應(yīng)體系 |
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ddH2O |
Up to 20 μL |
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2×Hieff Clone® Universal Enzyme Premix |
10 μL |
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線性化載體使用體積 |
X μL |
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插入片段使用體積 |
Y μL |
3.重組反應(yīng)條件
1）體系配制完成后，用移液器輕輕吸打混勻各組分，短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。
2）當插入1個片段并且DNA總量＜300 ng時，反應(yīng)條件為50℃，5 min；當插入片段數(shù)為2-6個時，建議反應(yīng)條件為50℃，15-60 min（反應(yīng)時間隨片段數(shù)增多而延長）。建議在PCR儀或金屬浴等溫控精確的儀器上進行反應(yīng)。
3）反應(yīng)產(chǎn)物可直接進行轉(zhuǎn)化，也可儲存于-20℃，待需要時解凍轉(zhuǎn)化。
二. 重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、涂板
1）在冰上解凍克隆感受態(tài)細胞（如：DH5α Chemically Competent Cell，Cat#11802）。
2）取10 μL冷卻重組產(chǎn)物，加入到100 μL感受態(tài)細胞中，輕彈管壁數(shù)下混勻，在冰上放置25 min。
3）42℃熱激50 sec，冰浴孵育1-2 min。
4）加入750 μL SOC或LB培養(yǎng)基，37℃孵育2 min充分復蘇。37℃，200 rpm，搖菌60 min。
5）5000 rpm離心3 min，棄掉750 μL上清。用剩余培養(yǎng)基將菌體重懸，用無菌涂布棒在含有正確抗性的平板上輕輕涂勻。待菌液被吸收，將平板倒置，于37℃過夜培養(yǎng)。
常見問答
1、最佳克隆位點選擇？
答：在選擇克隆位點時，應(yīng)避免選擇克隆位點上下游50 bp內(nèi)有重復序列的區(qū)域。當克隆位點上下游25 bp區(qū)域內(nèi)GC含量均在40%-60%范圍內(nèi)時，重組效率將達到最大。若高于70%或者低于30%，重組效率會受到較大影響。
2、無克隆長出或克隆數(shù)較少？
答：出現(xiàn)該情況，建議使用陽性對照，可排除試劑盒本身的影響，并進行進一步判定，主要有以下可能情況：
1）引物設(shè)計不合適：推薦【同源序列（15-25 bp）+完整的酶切位點+基因特異性擴增引物】，GC含量40% - 60%。
2）感受態(tài)細胞效率低：使用新鮮制備或妥善凍存的感受態(tài)細胞，確保其轉(zhuǎn)化效率>107 cfu/μg。每次操作時可設(shè)置一組轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的對照實驗，以檢測感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化效率。連接產(chǎn)物體積不應(yīng)超過感受態(tài)細胞體積的1/10，否則會降低轉(zhuǎn)化效率。
3）線性化載體和插入片段擴增產(chǎn)物的使用量不足/過量，或者比例不佳：盡量按照推薦的量和比例配制重組反應(yīng)體系。
4）線性化載體和插入片段擴增產(chǎn)物不純，抑制反應(yīng)：線性化載體和插入片段擴增產(chǎn)物未純化，直接使用時，使用總體積應(yīng)不超過反應(yīng)體系體積的1/5，如20 μL體系不超過4 μL。建議線性化載體、插入片段擴增產(chǎn)物進行凝膠回收純化，純化產(chǎn)物溶解在ddH2O中。
3、出現(xiàn)較多假陽性
答：主要有以下可能情況：
1）載體線性化不完全：即使是痕量未完全酶切的載體也會產(chǎn)生很高的轉(zhuǎn)化背景。可通過陰性對照檢測載體是否線性化完全，優(yōu)化酶切體系，提高限制性內(nèi)切酶使用量、延長酶切反應(yīng)時間、膠回收純化酶切產(chǎn)物等都可以有效減少環(huán)狀質(zhì)粒殘留。
2）插入片段擴增產(chǎn)物混有非特異擴增產(chǎn)物：建議：①優(yōu)化PCR體系，提高特異性；②膠回收PCR產(chǎn)物；③鑒定更多克隆。
3）反應(yīng)體系中混入了相同抗性的質(zhì)粒：PCR擴增模板(載體或插入片段)為環(huán)狀質(zhì)粒時，若擴增產(chǎn)物直接用于重組反應(yīng)，殘留環(huán)狀質(zhì)粒模板會產(chǎn)生較高的轉(zhuǎn)化背景。建議使用預(yù)線性化質(zhì)粒作為擴增模板、擴增產(chǎn)物進行DpnI消化或擴增產(chǎn)物進行膠回收純化。
4、菌落PCR無條帶
答：主要有以下可能情況：
1）引物不正確：推薦使用載體的通用引物或至少使用一條通用引物進行菌落PCR檢測。
2）PCR體系或程序不合適：沒有目的條帶也沒有空質(zhì)粒條帶，建議優(yōu)化PCR體系、程序；或者提取質(zhì)粒，以質(zhì)粒做模板PCR驗證；或者進行酶切驗證。
3）重組失?。?/font>沒有目的條帶，只有空質(zhì)粒的條帶，說明重組不成功，載體線性化不完全，建議優(yōu)化酶切體系。
HB230128
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