產(chǎn)品說明書
FAQ
COA
已發(fā)表文獻(xiàn)
產(chǎn)品簡介
本試劑盒是利用拓?fù)洚悩?gòu)酶（Topoisomerase）高效快速連接DNA片段的原理進(jìn)一步研發(fā)而成，與傳統(tǒng)的T4連接酶相比，具有以下優(yōu)勢：1）快速，僅需1-5分鐘即可完成連接反應(yīng)。2）高效，無自連現(xiàn)象，陽性克隆率接近100%，無需設(shè)置藍(lán)白斑篩選；3）操作簡單，從連接到涂板僅需15-20 min。操作過程省去冰浴、熱激和1 h復(fù)蘇等。4）可連接長達(dá)5 kb目的產(chǎn)物。
產(chǎn)品信息
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貨號(hào) |
10907ES08 / 10907ES20 / 10907ES50 |
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規(guī)格 |
5 T / 20 T / 50 T |
組分信息
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組分編號(hào) |
組分名稱 |
10907ES08 |
10907ES20 |
10907ES50 |
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10907-A |
pESI-T vector (30 ng/μL) |
5 μL |
20 μL |
50 μL |
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10907-B |
1 kb control insert (40 ng/μL) |
5 μL |
5 μL |
5 μL |
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10907-C |
10× Enhancer |
5 μL |
20 μL |
50 μL |
儲(chǔ)存條件
-25~-15℃保存，有效期1年。
使用說明
1. Control DNA 片段的克隆實(shí)驗(yàn)
1）在無菌微量離心管中配制下列DNA溶液，以10 μL為例。
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組分 |
用量 |
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10× Enhancer |
1 μL |
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1 kb control insert (40 ng/μL) |
1 μL |
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pESI-T vector (30 ng/μL) |
1 μL |
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ddH2O |
7 μL |
2）混勻上述體系。于室溫（20-30℃）反應(yīng)5 min。
*連接反應(yīng)不可于冰上進(jìn)行。反應(yīng)時(shí)間不要超過5 min，一般1-2 min即可完成連接反應(yīng)，得到足夠的重組子。
3）連接產(chǎn)物可直接轉(zhuǎn)化或于-20℃保存。
4）全量10 μL加入100 μL感受態(tài)細(xì)胞，輕輕混勻，室溫放置5 min。
*也可取5 μL連接液，加入50 μL感受態(tài)細(xì)胞中（加入體積不超過感受態(tài)細(xì)胞體積的1/10）。
**通常使用商品化的感受態(tài)細(xì)胞不需要冰浴和熱休克、室溫放置5 min便可獲得足夠多轉(zhuǎn)化子，如果感受態(tài)細(xì)胞效率較低時(shí)，可以按照冰浴熱激的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。
5）加300-500 μL LB或者SOC培養(yǎng)基（不含抗生素），37℃ 180 rpm振蕩培養(yǎng)10 min。
6）取200 μL菌液涂板（含氨芐抗性的LB或SOC固體培養(yǎng)基），培養(yǎng)過夜（如果預(yù)計(jì)轉(zhuǎn)化子少，為得到較多克隆，4,000 rpm 離心1 min，吸棄掉部分上清，保留100 μL，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板）。
2. 一般DNA片段的克隆實(shí)驗(yàn)
所插入片段為含A尾產(chǎn)物，利用常規(guī)Taq酶（Yeasen，Cat#10101ES-10106ES），或熱啟動(dòng)型Taq酶（Yeasen，Cat#10108ES03），或長片段DNA聚合酶（Yeasen，Cat#10158-10159ES）擴(kuò)增得到的產(chǎn)物如無非特異性條帶、引物二聚體可直接進(jìn)行連接反應(yīng)。
*PCR產(chǎn)物不能磷酸化。
**如擴(kuò)增模板為質(zhì)粒，模板質(zhì)粒會(huì)在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中引起假陽性，因此推薦PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收后連接。
1）按照下表配制連接體系（以10 μL為例）
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組分 |
用量 |
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10 ×Enhancer |
1 μL |
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pESI-T vector(30 ng/μL) |
1 μL |
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插入片段 |
0.5-8 μL |
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ddH2O |
To 10 μL |
*可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)情況按照上述比例調(diào)整反應(yīng)體系。
**不同的插入片段所用量參考下表：
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插入片段大小 |
推薦用量 |
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0.1-1 kb |
20-50 ng |
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1-2 kb |
50-100 ng |
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2-5 kb |
100-200 ng |
2）混勻上述體系。于室溫（20-30℃）反應(yīng)5 min。
*連接反應(yīng)不可于冰上進(jìn)行。反應(yīng)時(shí)間不要超過5 min，一般1-2 min即可完成連接反應(yīng)，得到足夠的重組子。
3）全量10 μL加入100 μL感受態(tài)細(xì)胞，輕輕混勻，室溫放置5 min。
*也可取5 μL連接液，加入50 μL感受態(tài)細(xì)胞中（加入體積不超過感受態(tài)細(xì)胞體積的1/10)。
**通常使用商品化的感受態(tài)細(xì)胞不需要冰浴和熱休克、室溫放置5 min便可獲得足夠多轉(zhuǎn)化子，如果感受態(tài)細(xì)胞效率較低時(shí)，可以按照冰浴熱激的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。
4）加300-500 μL LB或者SOC培養(yǎng)基（不含抗生素），37℃ 180 rpm振蕩培養(yǎng)10 min。
*通常商品化的感受態(tài)細(xì)胞不超過2 kb插入片段情況下，10 min復(fù)蘇可以得到足夠多轉(zhuǎn)化子，如果感受態(tài)效率低或者插入片段長轉(zhuǎn)化子少的情況下可以提高復(fù)蘇時(shí)間到30-60 min以得到更多的轉(zhuǎn)化子。
5）取200 μL菌液涂板（含氨芐抗性的LB或SOC固體培養(yǎng)基），培養(yǎng)過夜（如果預(yù)計(jì)轉(zhuǎn)化子少，為得到較多克隆，4,000 rpm 離心1 min，吸棄掉部分上清，保留100 μL，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板）。
6）轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定
a. 菌落/菌液PCR鑒定，用無菌的槍頭或牙簽將單個(gè)菌落挑至菌落PCR Mix中混勻（如：2×Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix (with Dye)，Cat#10157ES），加入引物直接進(jìn)行PCR反應(yīng)。
b. 質(zhì)粒大小鑒定：挑取單克隆，抽提質(zhì)粒后可根據(jù)質(zhì)粒大小進(jìn)行鑒定。
c. 酶切鑒定：根據(jù)克隆實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇合適的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行鑒定。
d. 測序分析：可選測序引物序列如下：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：CAGGAAACAGCTATGACC
*本制品陽性率相當(dāng)高，一般情況下，陽性克隆率接近100%，只要是長出來的菌落正常（不是污染的雜菌，轉(zhuǎn)化子數(shù)量也不算太少），基本就是陽性克隆，因此插入片段不超過2-3 kb的情況下可以不用鑒定直接挑1-2個(gè)菌去測序。
載體圖譜
pESI-T vector sequence
ORIGIN
1 cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct
61 gctgaagcca gttacctcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc
121 gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct
181 caagaagatc ctttgatttt ctaccgaaga aaggcccacc cgtgaaggtg agccagtgag
241 ttgattgtgt aaaacgacgg ccagtgtctg aggctcgctg cagtcctgaa gcttgatatc
301 gaattcgcgt gtcgccctta agggcgacac gcgaattcga tatcgcggcc gcctgcagtc
361 aatactgacg atggtcatag ctgtttcctg tccatagcag aaagtcaaaa gcctccgacc
421 ggaggctttt gacttgatcg gcacgtaaga ggttccaact ttcaccataa tgaaataaga
481 tcactaccgg gcgtattttt tgagttatcg agattttcag gagctaagga agctaaaatg
541 agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt
601 tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga
661 gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa
721 gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt
781 attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt
841 gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc
901 agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga
961 ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat
1021 cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct
1081 gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc
1141 cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg
1201 gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc
1261 ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg
1321 acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca
1381 ctgattaagc attggtaatg agggcccaaa tgtaatcacc tggctcacct tcgggtgggc
1441 ctttctgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat
1501 cgatgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc
1561 cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc
1621 gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt
1681 tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac
1741 cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg
1801 ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca
1861 gagtt
//
*黃底為多克隆酶切位點(diǎn)序列
注意事項(xiàng)
1.需自備的材料：
1）自備試劑（僅羅列部分）：
- 超級(jí)感受態(tài)：轉(zhuǎn)化效率＞108 cfu/μg，如翌圣DH5α超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞（Cat#11802ES）。
- 高保真酶：2× Hieff Canace® AdvanceFast PCR Master Mix (With Dye)（Cat#10164ES）或其他等效產(chǎn)品。
- 菌落PCR mix：2× Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix (with Dye)（Cat#10157ES）或其他等效產(chǎn)品。
- 核酸染料：YeaRed Nucleic Acid Gel Stain (10,000× in Water)（Cat#10202ES）或其他等效產(chǎn)品。
2）自備儀器耗材（僅羅列部分）：PCR儀，水平電泳槽，切膠儀，EP管等。
2.為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。
3.本產(chǎn)品僅作科研用途！
Ver.CN20230918
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