概述

神經(jīng)干細胞(neural stem cell)是指存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，具有分化為神經(jīng)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的潛能，從而能夠產(chǎn)生大量腦細胞組織，并能進行自我更新，并足以提供大量腦組織細胞的細胞群。

在神經(jīng)干細胞培養(yǎng)中B-27與N-2添加劑的使用十分廣泛，B-27是一種最常被引用的神經(jīng)細胞培養(yǎng)添加劑，是一種優(yōu)化的無血清添加劑，用于支持胚胎、出生后和成年海馬神經(jīng)元和其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）神經(jīng)元的生長和活性維持。翌圣生物提供的NSC-27 添加劑可以代替B-27添加劑。

 

圖1. 神經(jīng)干細胞的發(fā)展歷程
 

神經(jīng)系統(tǒng)疾病及治療機理
 

神經(jīng)系統(tǒng)疾病是指發(fā)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的以感覺、意識、運動等障礙為主要表現(xiàn)的疾病。包括帕金森病、阿爾茨海默病、卒中、肌萎縮性側(cè)索硬化癥（漸凍癥）、多發(fā)性硬化癥、亨廷頓病、小腦萎縮、脊髓損傷、外傷性腦損傷等。

神經(jīng)干細胞的治療機理是：（i）患病部位組織損傷后釋放各種趨化因子，可以吸引神經(jīng)干細胞聚集到損傷部位，并在局部微環(huán)境的作用下分化為不同種類的細胞，修復(fù)及補充損傷的神經(jīng)細胞。由于缺血、缺氧導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細胞、膠質(zhì)細胞的損傷，使局部通透性增加，另外在多種黏附分子的作用下，神經(jīng)干細胞可以透過血腦屏障，高濃度的聚集在損傷部位；（ii）神經(jīng)干細胞可以分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，促進損傷細胞的修復(fù)；（iii）神經(jīng)干細胞可以增強神經(jīng)突觸之間的聯(lián)系，建立新的神經(jīng)環(huán)路。

 

NCS-27添加劑的分類

1、動物源NSC-27

動物源成分是指直接來源于動物或間接來源于動物的成分，如牛肉膏、牛血清、人白蛋白、人免疫球蛋白、豬胰島素、胰蛋白酶等，這些動物源成分的異源蛋白在后續(xù)實驗中可能會引發(fā)人和動物的異體排斥或者過敏反應(yīng)。NSC-27中的血清蛋白成分為牛血清蛋白。

2、無動物源NSC-27

無動物源成分是指接觸的所有成分均不含任何動物成分，無動物源性產(chǎn)品可規(guī)避動物成分相關(guān)外源制劑帶來的安全風(fēng)險。NSC-27中的血清蛋白成分為重組人血清蛋白。

非動物源性NSC-27可更好的幫助下游iPSC客戶進行神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)研究。

 

NSC-27在神經(jīng)干細胞培養(yǎng)中的作用

1、優(yōu)化產(chǎn)前和胚胎神經(jīng)元的活性和長期存活率；

2、保證神經(jīng)來源的腫瘤細胞系的活性；

3、擴增來自小鼠胚胎紋狀體和中腦的EGF響應(yīng)性的前體細胞。

 

神經(jīng)干細胞培養(yǎng)實驗步驟
 

1. 完全培養(yǎng)基制備

培養(yǎng)基組分	添加量（mL）
神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基	98
NSC-27無血清添加劑,50X	2
L-丙氨酰-L谷氨酰胺，200mM	0.25

【注】原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)，神經(jīng)元完全培養(yǎng)基需要額外補充25 μM的L-谷氨酸，在培養(yǎng)的第4天以后的換液中應(yīng)不再添加L-谷氨酸。配置好的完全培養(yǎng)基，可于2-8℃的避光保存一周。

2. 細胞培養(yǎng)步驟

下列步驟已在大鼠胎兒原代海馬和皮層神經(jīng)元，以及神經(jīng)母細胞瘤細胞系中測試。

1) 用無菌的冷的0.05 mg/mL多聚賴氨酸水溶液包被培養(yǎng)表面(玻璃或細胞培養(yǎng)級塑料)，每平方厘米表面使用0.15 mL，在室溫下保溫1 h。

2) 去除多聚賴氨酸溶液，并用無菌蒸餾水沖洗兩次(須徹底清洗，因為多聚賴氨酸對細胞有毒性)。在超凈工作臺中打開培養(yǎng)板的蓋子通風(fēng)，直到每個孔都完全干燥。培養(yǎng)板干燥后可以立即使用或在4°C最多保存2周。

3) 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)實驗室程序或隨細胞提供的說明書分離原代的大鼠神經(jīng)元或解凍凍存的原代大鼠神經(jīng)元。

4) 在預(yù)熱的(37°C)神經(jīng)元完全培養(yǎng)基中（如前所述的方法制備)接種細胞，建議的細胞密度為160個細胞/mm2，或必要時使用自行優(yōu)化的細胞密度。

【注】對于海馬神經(jīng)元，培養(yǎng)基中須添加25 μM L-谷氨酸，參見“完全培養(yǎng)基的制備”。

5) 在36°C至38°C，含5%二氧化碳的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)（使用自然空氣也是可接受的，但推薦含9%氧氣和5%二氧化碳的氣體環(huán)境）。

6) 培養(yǎng)4-24 h后，更換一半體積的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

7) 對海馬神經(jīng)元以外的細胞：在接種4天后，更換一半體積的新鮮的完全培養(yǎng)基，之后每三天重復(fù)一次。對海馬神經(jīng)元：接種三天后，用不含L-谷氨酸的新鮮培養(yǎng)基更換一半體積的培養(yǎng)基。之后每三天重復(fù)一次。

【注】在完全培養(yǎng)基中添加25 µM 2-巰基乙醇，可改善海馬神經(jīng)元的長期存活率。

3. 分離原代大鼠胚胎神經(jīng)元

下列程序推薦用于培養(yǎng)受精18天的大鼠胚胎海馬神經(jīng)元和大腦皮層神經(jīng)元。

1) 從受精18天的大鼠胚胎中分離大腦皮層和雙側(cè)海馬

2) 在預(yù)置了Hibernate-E完全培養(yǎng)基的錐形管中收集所有的組織。放置，直到所有的組織都已解體。

3) 使組織沉積在管的底部，然后小心地去除上清液，只留下剛好可覆蓋組織的最少量的培養(yǎng)基。

4) 在不含鈣離子的Hibernate-E培養(yǎng)基中，使用2 mg/mL過濾滅菌的木瓜蛋白酶溶液，在30°C酶解組織大約30 min，其間每5 min輕搖錐形管以幫助降解。每對海馬組織使用2 mL酶溶液。

5) 加入兩倍體積的Hibernate-E完全培養(yǎng)基以恢復(fù)二價陽離子的濃度，停止酶解。

6) 使未解離的組織沉降至管底（約2 min），然后把上清液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，以150×g離心5 min。

7) 在1 mL神經(jīng)元完全培養(yǎng)基中重懸沉淀物，取一小份(例如10 μL)進行細胞計數(shù)。后續(xù)的操作按照“復(fù)蘇和培養(yǎng)凍存的神經(jīng)元”的第8-10步驟進行。

4. 復(fù)蘇和培養(yǎng)凍存的神經(jīng)元

原代神經(jīng)元細胞將會貼附在裸露的塑料或玻璃表面，建議事先用神經(jīng)元完全培養(yǎng)基沖洗所有的塑料和玻璃器皿的內(nèi)表面，以獲得最高的回收率和產(chǎn)量。由于細胞從凍存狀態(tài)復(fù)蘇時極其脆弱，請在整個操作過程中不要震蕩或離心細胞。我們建議每次只解凍一管細胞。務(wù)必減少從液氮中轉(zhuǎn)移凍存管到37°C水浴中的操作時間。細胞從液氮罐到水浴的運輸過程中，可在冰桶中放少量液氮，將細胞置于這個冰桶中來進行。

1) 在解凍細胞之前，用神經(jīng)元完全培養(yǎng)基沖洗無菌的15 mL錐形管，然后在超凈工作臺中通風(fēng)晾干。

2) 從液氮中取出凍存管時可稍微擰松管帽以釋放壓力，然后再擰緊。

3) 在37°C水浴中輕柔攪拌凍存管以快速解凍細胞（＜2 min）。當(dāng)觀察到凍存管中只有很少量的冰晶存在時（觸摸凍存管仍然感覺是冷的）從水浴中取出。

4) 在超凈工作臺中用70%的異丙醇消毒凍存管。在工作臺臺面上輕敲凍存管以使管內(nèi)液體沉降到管底。

5) 使用事先用神經(jīng)元完全培養(yǎng)基沖洗并干燥過的1 mL吸頭極其輕柔地將細胞轉(zhuǎn)移到事先沖洗并干燥的15 mL錐形管中。

6) 用1 mL預(yù)熱的神經(jīng)元完全培養(yǎng)基沖洗沖洗凍存管，以每秒一滴的速度極其緩慢地加入到15 mL錐形管中的細胞里。每加一滴都輕柔地轉(zhuǎn)動錐形管一次。不要一次即把全部培養(yǎng)基加到錐形管中。

7) 慢慢地逐滴加入另外2 mL預(yù)熱的完全培養(yǎng)基，使管內(nèi)的液體體積為4 mL。用1 mL吸頭輕柔地混合液體，注意不要造成任何氣泡。

8) 用一個事先沖洗干燥過的吸頭吸取10μL細胞懸液加入到含有10μL 0.4%臺盼藍的微量離心管中，輕敲管壁以混勻溶液。使用手動的細胞計數(shù)方法測定活細胞密度。解凍的細胞的活率應(yīng)超過50%。

9) 在已經(jīng)事先用多聚賴氨酸包被（參見“細胞培養(yǎng)步驟”）的48孔板中每孔中接種大約1×105個細胞或按所需的細胞密度接種。加入預(yù)熱的神經(jīng)元完全培養(yǎng)基將細胞懸液稀釋到每孔500μL。

10) 按照“細胞培養(yǎng)步驟”中的5-6步驟進行神經(jīng)元的培養(yǎng)。在36°C至38°C，含5%二氧化碳的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)（使用自然空氣也是可接受的，但推薦含9%氧氣和5%二氧化碳的氣體環(huán)境）。
 

常見問題

可能出現(xiàn)的問題	解決辦法
3款NSC-27無血清添加劑的區(qū)別？	NSC-27（60703ES/60711ES）用于神經(jīng)元長期生存培養(yǎng)的完整配方。 NSC-27,去除維生素A（60704ES/60712ES）是干細胞增殖的理想選擇。（去除維生素A，可防止神經(jīng)干細胞向神經(jīng)細胞分化） NSC-27,無抗氧化劑（60705ES）是研究細胞凋亡，氧化損傷，或發(fā)生神經(jīng)元自由基損傷的應(yīng)用的理想選擇。（抗氧化劑會影響氧化應(yīng)激及損傷、氧自由基對神經(jīng)損傷和凋亡，去除抗氧化劑可排除抗氧化劑的干擾）
無動物源添加劑與動物源添加劑相比，優(yōu)勢是什么？	具有相同的生物活性，同時避免痕量的動物成分、動物病原體和抗原對實驗造成影響。
NSC-27無血清添加劑與N-2無血清添加劑的區(qū)別？	NSC-27 補充劑用來培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，海馬和其他CNS神經(jīng)元。 N-2補充劑用來培養(yǎng)神經(jīng)母細胞瘤，或來自PNS和CNS的有絲分裂后神經(jīng)元。
添加NSC-27的培養(yǎng)基可保存多長時間？	一旦將NSC-27補充劑添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，應(yīng)在2-4周內(nèi)使用培養(yǎng)基。
可以在37℃的水浴或培養(yǎng)箱中解凍NSC-27補充劑嗎？	不建議在37℃下解凍，在室溫下解凍約2h或在2-8℃下過夜時觀察到最佳結(jié)果。

 

名詞小貼士：

神經(jīng)（Nerve），是由聚集成束的神經(jīng)纖維所構(gòu)成。 而神經(jīng)纖維本身是由多個神經(jīng)元細胞構(gòu)成，其神經(jīng)元的構(gòu)造為軸突外并被神經(jīng)膠質(zhì)細胞所形成的髓鞘包覆。 如此神經(jīng)能將訊息從動物身體一處傳遞到另外一處，使動物能協(xié)調(diào)指揮動作與進行各種工作。

神經(jīng)元（neuron），又名神經(jīng)原或神經(jīng)細胞，是神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能單位之一。人腦中，神經(jīng)細胞約有860億個。

神經(jīng)干細胞（NSCs），是自我更新的多能細胞，可分化為神經(jīng)系統(tǒng)的主要表型。這些細胞類型包括神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。

神經(jīng)祖細胞（NPC），是干細胞分裂的后代，其通常在體內(nèi)經(jīng)歷有限數(shù)量的復(fù)制循環(huán)。大腦中有許多“專業(yè)的”細胞，比如神經(jīng)細胞，少突膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞。神經(jīng)細胞傳遞和接受信息。少突膠質(zhì)細胞包裹著神經(jīng)細胞，為神經(jīng)細胞更快地傳遞信息提供幫助。星形膠質(zhì)細胞(星形細胞)通過提供營養(yǎng)和從身體的其他部位調(diào)節(jié)進入大腦來支持神經(jīng)系統(tǒng)。

產(chǎn)品優(yōu)勢:

1、高效培養(yǎng)，質(zhì)量優(yōu)良；

2、質(zhì)控嚴格，嚴格無菌、無內(nèi)毒素；

3、批次穩(wěn)定，批間差異小；

4、貨期迅速，現(xiàn)貨供應(yīng)；

5、選擇多樣，動物源與非動物源。

 

試劑訂購
 

培養(yǎng)基及添加劑

 

產(chǎn)品名稱		貨號		規(guī)格
NSC-27 supplement, serum free, 50X 無血清 NSC-27 添加劑	60703ES		10 mL
NSC-27 supplement without Vitamin A, serum free, 50X 無血清 NSC-27 添加劑,去除維生素A	60704ES		10 mL
NSC-27 supplement without Antioxidant, serum free, 50X 無血清 NSC-27 添加劑,無抗氧化劑		60705ES		10 mL
N-2 supplement,serum free,100X N-2無血清添加 劑，100×		60706ES		5 mL
NSC-27 supplement, serum free, 50X(animal origin-free)無血清 NSC-27 添加劑(非動物源)		60711ES		10 mL
NSC-27 supplement without Vitamin A, serum free, 50X(animal origin-free) 無血清 NSC-27 添加劑,去除維生素A(非動物源）		60712ES		10 mL
N-2 supplement,serum free,100X N-2無血清添加劑,100X(非動物源）		60713ES		5 mL
HEPES Free Acid 細胞培養(yǎng)級		60110ES		100 g/500 g
L-alanyl-L-glutamine solution，200mM L-丙氨 酰-L-谷氨酰胺，200mM		60701ES		20 mL/100 mL/500 mL
Penicillin-Streptomycin (100×), Suitable for Cell Culture 細胞培養(yǎng)用青霉素-鏈霉素（雙抗）		60162ES		100 mL
Ceturegel™ Matrix LDEV-Free基質(zhì)膠		40183ES		5 mL/10 mL

 

小分子化合物（抑制劑/激活劑）

 

產(chǎn)品名稱	貨號	規(guī)格
Y-27632	53006ES	1 mg/5 mg/10 mg
MK-2206 2HCl	53008ES	1 mg/5 mg/10 mg
GDC-0068(Ipatasertib; RG7440; GDC0068)	53009ES	1 mg/5 mg/10 mg
Dorsomorphin dihydrochloride  (Dorsomorphin 2HCl)	53010ES	1 mg/5 mg/10 mg
Y-27632 dihydrochloride	52604ES	5 mg/10 mg/25 mg

細胞因子

 

產(chǎn)品名稱	貨號	規(guī)格
Recombinant Human DKK-1	92275ES	20 μg/100 μg/500 μg
Recombinant Human EGF	92701ES	100 μg/500 μg
Recombinant Human bFGF	91330ES	10 μg/100 μg/500 μg
Recombinant Human GDNF	92102ES	10 μg/100 μg/500 μg
Recombinant Human Noggin	92528ES	5 μg/100 μg/500 μg
Recombinant Human BDNF	92129ES	5 μg/20 μg/100 μg