Hieff UNICON? ColorGPS qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox)
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產(chǎn)品說明書
FAQ
COA
已發(fā)表文獻(xiàn)
產(chǎn)品簡介
Hieff UNICON® ColorGPS qPCR SYBR Green Master Mix(No Rox)是2×實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增的預(yù)溶液，具有熒光強(qiáng)度高，靈敏度高和特異性強(qiáng)，擴(kuò)增產(chǎn)量高等特點(diǎn)。核心組分Hieff UNICON® Taq DNA聚合酶采用抗體法熱啟動(dòng)，可以有效抑制樣品準(zhǔn)備過程中引物退火導(dǎo)致的非特異性擴(kuò)增。同時(shí)配方添加了提升PCR反應(yīng)擴(kuò)增效率因子和均衡不同GC含量（30~70%）基因擴(kuò)增的促進(jìn)因子，使定量PCR可以在寬廣的定量區(qū)域內(nèi)獲得良好的線性關(guān)系。該產(chǎn)品利用不同染料的混合變色反應(yīng)來監(jiān)控移液操作，有效降低了移液誤差的發(fā)生。
組分信息
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組分編號(hào) |
組分名稱 |
11188ES03 |
11188ES08 |
11188ES60 |
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11188-A |
Hieff UNICON® ColorGPS qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) |
1 mL |
5×1 mL |
100×1 mL |
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11188-B |
10×Dilution Buffer |
1 mL |
1 mL |
20×1 mL |
儲(chǔ)存條件
-25~-15℃避光保存，有效期1年。
使用說明
- Hieff UNICON® ColorGPS qPCR SYBR Green Master Mix 中包含藍(lán)色染料，10×Dilution Buffer為專用黃色濃縮模板稀釋液。使用過程中，如需要進(jìn)行模板示蹤，則需稀釋到1X作為模板稀釋液使用，然后進(jìn)行qPCR檢測；如不需要進(jìn)行模板示蹤，則不使用Dilution Buffer即可。
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模板類型 |
10×Dilution Buffer使用方式* |
Dilution Buffer 終濃度 |
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cDNA溶液、已溶解的質(zhì)粒、基因組 |
若要稀釋模板，則先使用無菌超純水將模板稀釋至目標(biāo)濃度，后在每9 μL模板中加入1 μL 10×Dilution Buffer。 |
1× |
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未溶解的DNA粉末 |
使用無菌超純水將10×Dilution Buffer 稀釋至1×，使用合適體積的1×Dilution Buffer作溶劑溶解對(duì)應(yīng)的DNA粉末。 |
1× |
*實(shí)際使用過程中也可按需使用其他方案，保證最終模板中Dilution Buffer濃度為1×即可。
- 推薦qPCR反應(yīng)體系
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組分 |
體積 （μL）*** |
體積 （μL）*** |
終濃度 |
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Hieff UNICON® ColorGPS qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) |
25 |
10 |
1× |
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Forward Primer (10 μM)* |
1 |
0.4 |
0.2 μM |
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Reverse Primer (10 μM)* |
1 |
0.4 |
0.2 μM |
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模板DNA/cDNA** |
x |
x |
- |
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無菌超純水 |
Up to 50 |
Up to 20 |
- |
*通常引物終濃度為0.2 μM，也可以根據(jù)情況在0.1-1.0 μM之間進(jìn)行調(diào)整。
**如模板為未稀釋cDNA原液，使用體積不應(yīng)超過qPCR反應(yīng)總體積的1/10，最佳模板加入量以保證擴(kuò)增得到的Ct值在20-30個(gè)循環(huán)為宜。
***推薦使用20 μL或50 μL，以保證目的基因擴(kuò)增的有效性和重復(fù)性；上機(jī)前需充分混勻，避免劇烈震蕩產(chǎn)生過多氣泡。
- 反應(yīng)程序
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循環(huán)步驟 |
溫度 |
時(shí)間 |
循環(huán)數(shù) |
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預(yù)變性 |
95℃ |
2 min |
1 |
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變性 |
95℃ |
10 sec |
40 |
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退火/延伸* |
60℃ |
30 sec** |
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熔解曲線階段* |
儀器默認(rèn)設(shè)置 |
1 |
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*退火溫度和時(shí)間：請(qǐng)根據(jù)引物TM值和目的基因的長度進(jìn)行調(diào)整。
**熒光信號(hào)采集：請(qǐng)勿忘記打開熒光信號(hào)采集，按照儀器使用說明書要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)程序設(shè)置。
***熔解曲線：通常情況下可以使用儀器默認(rèn)程序。
適用機(jī)型
本產(chǎn)品中不包含用以校正孔與孔之間熒光信號(hào)誤差的ROX Reference Dye，適用于以下熒光定量PCR儀：Bio-Rad CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ; MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4; Cepheid SmartCycler; Eppendorf Mastercycler ep realplex, realplex 2 s; Illumina Eco qPCR; Qiagen/Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;Roche Applied Science LightCycler 480; Thermo Scientific PikoReal Cycler; 及其他不需要添加ROX Reference Dye的熒光定量PCR儀。
引物設(shè)計(jì)指南
- 推薦引物長度25 bp左右。擴(kuò)增產(chǎn)物長度150 bp為佳，可以在100 bp-300 bp內(nèi)選擇。
- 正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超過2℃。引物Tm值60℃-65℃為佳。
- 引物堿基分布均勻，避免出現(xiàn)連續(xù)的4個(gè)相同堿基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一個(gè)堿基最好為G或C。
- 引物內(nèi)部或者正反兩條引物間最好避免出現(xiàn)有3個(gè)堿基以上的互補(bǔ)序列。
- 引物特異性需要用NCBI BLAST程序進(jìn)行核對(duì)。避免引物 3’端有2個(gè)堿基以上的非特異性互補(bǔ)。
- 設(shè)計(jì)完成的引物需要進(jìn)行擴(kuò)增效率的檢測，只有具備相同擴(kuò)增效率的引物才可用于定量比較分析。
注意事項(xiàng)
- 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
- 解凍后Master Mix可能出現(xiàn)絮狀或白色沉淀，手握緩慢溶解并上下輕柔顛倒混勻至溶液澄清，不影響試劑性能。
- 使用前請(qǐng)上下顛倒以混勻Master Mix，請(qǐng)勿vortex避免產(chǎn)生氣泡，影響定量結(jié)果。Master Mix經(jīng)混勻短暫離心后即可使用。加樣過程中吹打要輕，如果操作不慎Master Mix起泡，需再次離心方可使用。
- 由于本品檢測靈敏度極高，易被空氣中氣溶膠污染。因此反應(yīng)體系配制時(shí)請(qǐng)于超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，配制過程中請(qǐng)使用滅菌槍頭、反應(yīng)管，條件容許的實(shí)驗(yàn)室推薦使用專用的移液槍和帶濾芯的槍頭。
- 推薦使用本公司cDNA合成試劑盒（貨號(hào)：11155ES），以有效去除RNA樣品中殘留的基因組。
- 本產(chǎn)品僅作科研用途！
Ver.CN20241011
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