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      Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit  Annexin V-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒
       
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      產(chǎn)品說明書
                  
      FAQ
                  
      COA
                  
      已發(fā)表文獻
                  
       
      Annexin V-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒是用紅色熒光染料PE（Phycoerythrin）標(biāo)記的Annexin V作為探針，來檢測細胞早期凋亡的發(fā)生，可用熒光顯微鏡、流式細胞儀或其他熒光檢測設(shè)備進行檢測。
      


      其檢測原理為：在正常的活細胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細胞膜的內(nèi)側(cè)，但在早期凋亡的細胞中，PS 從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca2+ 依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合。可通過細胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結(jié)合。
      


      另外，本試劑盒中提供的7-AAD可用來區(qū)分存活的早期細胞和壞死或晚期凋亡細胞。7-AAD是一種核酸染料，同PI有著相似的熒光特性，但其發(fā)射光譜較PI窄，對其他檢測通道的干擾更小，在多色熒光分析中是PI的最佳替代品，可與Annexin V聯(lián)合使用。該染料不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整的細胞膜，但可穿透晚期凋亡細胞或者壞死細胞并與其內(nèi)的DNA結(jié)合。因此將Annexin V-PE與7-AAD聯(lián)合使用時，7-AAD則被排除在活細胞（Annexin V-/7-AAD-）和早期凋亡細胞（Annexin V+/7-AAD-）之外，而晚期凋亡細胞和壞死細胞同時被Annexin V-PE和7-AAD結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽性（Annexin V+/7-AAD+）。
      


       
      


      產(chǎn)品組分
      


      
	
		
      
			
			
      編號
      
			      		
			
			
      組分名稱
      
			      		
			
			
      產(chǎn)品編號/規(guī)格
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      40310ES20
      

			
      （20T）
      
			      		
			
			
      40310ES50
      

			
      （50T）
      
			      		
			
			
      40310ES60
      

			
      （100T）
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      40310-A
      
			      		
			
			
      重組人Annexin V/PE*（rh Annexin V/PE）
      
			      		
			
			
      100 µL
      
			      		
			
			
      250 µL
      
			      		
			
			
      500 µL
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      40310-B
      
			      		
			
			
      7-AAD Viability Staining Solution（20µg/mL）
      
			      		
			
			
      200 µL
      
			      		
			
			
      500 µL
      
			      		
			
			
      1.0 mL
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      40310-C
      
			      		
			
			
      4×Binding Buffer**
      
			      		
			
			
      4 mL
      
			      		
			
			
      10 mL
      
			      		
			
			
      20 mL
      
			      		
		
      
	      

      


      *來源于大腸桿菌（E.coli），分子量為35.8 KDa，純度＞98%（SDS-PAGE & HPLC）
      


       
      


      運輸與保存方法
      


      冰袋（wet ice）運輸。本試劑盒中所有組分均在4 ℃保存，勿冰凍。Annexin V-PE、7-AAD需避光保存。一年有效。
      


       
      


      注意事項
      


      1）試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。
      


      2）由于細胞凋亡是一個快速的過程，建議樣品在染色后1小時之內(nèi)進行分析。
      


      3）對于貼壁細胞，消化是一個關(guān)鍵步驟。貼壁細胞誘導(dǎo)細胞凋亡時如有漂浮細胞，需收集漂浮細胞和貼壁細胞后合并染色。處理貼壁細胞時要小心操作，盡量避免人為的損傷細胞。胰酶消化時間過短，細胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細胞膜的損傷，7-AAD攝入過多；消化時間過長，細胞膜同樣易造成損傷，甚至?xí)绊懠毎ど狭字＝z氨酸與Annexin V-PE的結(jié)合。消化時將胰酶鋪滿孔板底后，輕搖時胰酶與細胞充分接觸，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段時間，待細胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止。在消化液中盡量不用EDTA，EDTA會影響Annexin V與PS的結(jié)合。
      


      4）如果樣品來源于血液，請務(wù)必除去血液中的血小板。因為血小板含有PS，能與Annexin V結(jié)合，從而干擾實驗結(jié)果?？梢允褂煤蠩DTA的緩沖劑并低速離心（200×g）洗去血小板，然后用Annexin V結(jié)合緩沖液清洗細胞，以避免殘留的EDTA會螯合Ca2+。
      


      5）7-AAD為潛在致癌物，操作時請采取防護措施，穿防護服、戴手套等。
      


      6）Annexin V-PE和7-AAD是光敏物質(zhì)，在操作時請注意避光。
      


      7）本產(chǎn)品僅作科研用途！
      


       
      


      使用說明
      


      1. 樣品染色
      


      1） 懸浮細胞：300 g，4 ℃離心5 min收集細胞。
      


      貼壁細胞：用不含EDTA的胰酶消化后，300g，4 ℃離心5 min收集細胞。胰酶消化時間不宜過長，以防引起假陽性。
      


      2）配制1×Binding Buffer：用去離子水4倍稀釋4×Binding Buffer（4 mL 結(jié)合緩沖液+12 mL 去離子水）。
      


      3）用4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌細胞2次，每次均需300 g，4 ℃離心5 min。
      


      4）加入250 μL 1×Binding Buffer重懸細胞，調(diào)節(jié)其濃度為1×106細胞/mL。
      


      5）取100 μL細胞懸液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V/PE和10 μL 7-AAD，輕輕混勻。
      


      6）避光、室溫反應(yīng)15 min。
      


      7）加入400 μL 1×Binding Buffer，混勻，樣品在1小時內(nèi)檢測。
      


      【注】：為了避免洗滌細胞時損失細胞，在吸液時可以用大的Tip頭套上小的Tip頭吸液。
      


      2. 觀察檢測
      


      A、流式細胞儀分析
      


      1）用流式細胞儀檢測，Annexin V-PE的激發(fā)波長Ex=488nm；發(fā)射波長Em=578 nm，發(fā)出橙紅色熒光，建議使用FL2通道檢測；7-AAD的激發(fā)波長Ex=546 nm；發(fā)射波長Em=647 nm，發(fā)出紅色熒光，建議使用FL3通道檢測。用CellQuest等軟件進行分析，繪制雙色散點圖（two-color dot plot），PE為橫坐標(biāo)，7-AAD為縱坐標(biāo)。每個樣采集10,000 events。典型的實驗中，細胞可以分成三個亞群，活細胞僅呈很低強度的背景熒光，早期凋亡細胞僅呈較強的橙紅色熒光，晚期凋亡細胞呈橙紅和紅色熒光雙重染色。
      


      2）熒光補償調(diào)節(jié)：使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的正常細胞，作為對照進行熒光補償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設(shè)定十字門的位置。
      


      B、熒光顯微鏡觀察
      


      1）滴一滴上述染色后的細胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細胞；
      


      2）對于貼壁細胞來說，也可直接用蓋玻片來培養(yǎng)細胞并誘導(dǎo)細胞凋亡；
      


      a 將細胞于蓋玻片上生長，用適當(dāng)?shù)牡蛲稣T導(dǎo)劑誘導(dǎo)細胞凋亡，并設(shè)立陰性對照組；
      


      b 用PBS洗滌細胞兩次；
      


      c 在500 μL的Binding Buffer 中加入1 μL Annexin V-PE，5 μL 7-AAD染液混勻；
      


      d 將上述溶液滴加于蓋玻片表面，使長有細胞的蓋玻片表面均勻覆蓋；
      


      e 室溫避光孵育5 min。
      


      3）將蓋玻片倒置于載玻片上，在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。濾光片（羅丹明）觀察Annexin V-PE 熒光信號呈橙紅色；用激發(fā)波長546 nm，發(fā)射波長647 nm，觀察7-AAD熒光信號呈紅色。
      


       
      



      
HB210802
      


       
      

         
       
       
       
       
       
       
       
      400-6111-883