Hieff Clone^® Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit是利用新一代拓?fù)洚悩?gòu)酶(Topoisomerase)高效快速連接DNA片段的原理進(jìn)一步研發(fā)而成，搭配高效的平末端化因子，兼容平末端產(chǎn)物及粘性末端產(chǎn)物的快速克隆。與傳統(tǒng)的連接酶相比，具有以下優(yōu)勢：1) 快速，僅需5分鐘即可完成連接反應(yīng)。2) 高效，無自連現(xiàn)象，陽性克隆率接近100%，無需設(shè)置藍(lán)白斑篩選；3) 可連接長達(dá)5 kb目的產(chǎn)物。

 

組分信息

組分編號	組分名稱	10906ES08	10906ES20	10906ES50
10906-A	2× Hieff Clone® Universal TOPO Cloning Premix	25 μL	100 μL	250 μL
10906-B	1 kb control insert (40 ng/μL)	10 μL	10 μL	10 μL
10906-C	M13 Forward Primer(10 μM)	50 μL	200 μL	500 μL
10906-D	M13 Reverse Primer(10 μM)	50 μL	200 μL	500 μL

 

儲存條件

-25~-15℃保存，有效期1年。

 

使用說明

1. 反應(yīng)體系

組分	用量
2× Hieff Clone® Universal TOPO Cloning Premix	5 μL
插入片段*	0.5-5 μL
ddH2O	To 10 μL

*PCR 產(chǎn)物不能磷酸化。如擴(kuò)增模板為質(zhì)粒，模板質(zhì)粒會(huì)在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中引起假陽性，因此推薦PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收后連接。0.1-1 kb片段投入量推薦20-50 ng，1-2 kb片段投入量推薦50-100 ng，2-4 kb片段投入量推薦100-200 ng，4-5 kb片段投入量推薦200-300 ng。

2. 反應(yīng)條件

混勻上述體系，于室溫(20-37℃)反應(yīng)5 min。連接反應(yīng)不可于冰上進(jìn)行。室溫(20-37℃)下孵育時(shí)，建議孵育時(shí)間不超過5 min，如果PCR產(chǎn)物濃度較低或者片段較長，則可以適當(dāng)延長孵育時(shí)間，不宜超過15 min（推薦使用25℃，PCR儀控溫）。

3. 轉(zhuǎn)化

1）在冰上解凍克隆感受態(tài)細(xì)胞（如：DH5α Chemically Competent Cell，Cat#11802ES）。

2）取10 μL冷卻重組產(chǎn)物，加入到100 μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁數(shù)下混勻，在冰上放置25 min。

3）42℃熱激60 sec，冰上孵育2 min。

4）加入500 μL SOC或LB培養(yǎng)基，37℃，200 rpm，搖菌60 min。

5）5000 rpm離心4 min，棄上清至100 μL，用剩余培養(yǎng)基重懸菌體。用無菌涂布棒將菌液均勻涂抹在含有正確抗性的平板上。待菌液被培養(yǎng)基吸收后，倒置平板，于37℃過夜培養(yǎng)。

4. 克隆鑒定

可選擇測序法或酶切法進(jìn)行鑒定。用無菌的槍頭或牙簽將單個(gè)菌落挑至菌落PCR Mix中混勻（如：2×Hieff^® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix (with Dye)，Cat#10157ES），加入引物直接進(jìn)行PCR反應(yīng)。測序引物：

M13F ：GTAAAACGACGGCCAGT

M13R ：CAGGAAACAGCTATGAC

 

載體信息