產(chǎn)品簡介

 

本試劑盒是利用拓撲異構(gòu)酶（Topoisomerase）高效快速連接DNA片段的原理進一步研發(fā)而成，與傳統(tǒng)的T4連接酶相比，具有以下優(yōu)勢：1）快速，僅需1-5分鐘即可完成連接反應(yīng)。2）高效，無自連現(xiàn)象，陽性克隆率接近100%，無需設(shè)置藍白斑篩選；3）操作簡單，從連接到涂板僅需15-20 min。操作過程省去冰浴、熱激和1 h復(fù)蘇等。4）可連接長達5 kb目的產(chǎn)物。

用于平末端PCR產(chǎn)物的快速克隆；克隆后PCR產(chǎn)物的快速測序（使用M13F/M13R引物）。

 

產(chǎn)品信息

 

貨號	10909ES20
規(guī)格	20 T

 

組分信息

 

組分編號	組分名稱	10909ES20
10909-A	pESI-Blunt vector (30 ng/μL)	20 μL
10909-B	1 kb control insert (40 ng/μL)	5 μL
10909-C	10× Enhancer	20 μL

 

儲存條件

 

-25~-15℃保存，有效期1年。

 

使用說明

 

1. Control DNA 片段的克隆實驗

1）在無菌微量離心管中配制下列DNA溶液，以10 μL為例。

組分	用量
10 ×Enhancer	1 μL
1 kb control insert (40 ng/μL)	1 μL
pESI-Blunt vector (30 ng/μL)	1 μL
ddH2O	7 μL

2）混勻上述體系。于室溫（20-30℃）反應(yīng)5 min。

*連接反應(yīng)不可于冰上進行。反應(yīng)時間不要超過5 min，一般1-2 min即可完成連接反應(yīng)，得到足夠的重組子。

3）連接產(chǎn)物可直接轉(zhuǎn)化或于-20℃保存。

4）全量10 μL加入100 μL感受態(tài)細胞，輕輕混勻，室溫放置5 min。

*也可取5 μL連接液，加入50 μL感受態(tài)細胞中（加入體積不超過感受態(tài)細胞體積的1/10）。

**通常使用商品化的感受態(tài)細胞不需要冰浴和熱休克、室溫放置5 min便可獲得足夠多轉(zhuǎn)化子，如果感受態(tài)細胞效率較低時，可以按照冰浴熱激的標準程序進行。

5）加300-500 μL LB或者SOC培養(yǎng)基（不含抗生素），37℃ 180 rpm振蕩培養(yǎng)10 min。

 6）取200 μL菌液涂板（含氨芐抗性的LB或SOC固體培養(yǎng)基），培養(yǎng)過夜（如果預(yù)計轉(zhuǎn)化子少，為得到較多克隆，4,000 rpm 離心1 min，吸棄掉部分上清，保留100 μL，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板）。

2. 一般DNA片段的克隆實驗

所插入片段為平末端產(chǎn)物，利用高保真DNA聚合酶（Yeasen，Cat#10164ES）擴增得到的產(chǎn)物如無非特異性條帶、引物二聚體可直接進行連接反應(yīng)。

否則建議膠回收后使用。

*PCR產(chǎn)物不能磷酸化。

**如擴增模板為質(zhì)粒，模板質(zhì)粒會在后續(xù)實驗中引起假陽性，因此推薦PCR產(chǎn)物進行膠回收后連接。

1）按照下表配制連接體系（以10 μL為例）

組分	用量
10 ×Enhancer	1 μL
pESI-Blunt vector(30 ng/μL)	1 μL
插入片段	0.5-8 μL
ddH2O	To 10 μL

*可根據(jù)具體實驗情況按照上述比例調(diào)整反應(yīng)體系。

**不同的插入片段所用量參考下表：

插入片段大小	推薦用量
0.1-1 kb	20-50 ng
1-2 kb	50-100 ng
2-5 kb	100-200 ng

2）混勻上述體系。于室溫（20-30℃）反應(yīng)5 min。

*連接反應(yīng)不可于冰上進行。反應(yīng)時間不要超過5 min，一般1-2 min即可完成連接反應(yīng)，得到足夠的重組子。

3）全量10 μL加入100 μL感受態(tài)細胞，輕輕混勻，室溫放置5 min。

*也可取5 μL連接液，加入50 μL感受態(tài)細胞中（加入體積不超過感受態(tài)細胞體積的1/10)。

**通常使用商品化的感受態(tài)細胞不需要冰浴和熱休克、室溫放置5 min便可獲得足夠多轉(zhuǎn)化子，如果感受態(tài)細胞效率較低時，可以按照冰浴熱激的標準程序進行。

4）加300-500 μL LB或者SOC培養(yǎng)基（不含抗生素），37℃ 180 rpm振蕩培養(yǎng)10 min。

*通常商品化的感受態(tài)細胞不超過2 kb插入片段情況下，10 min復(fù)蘇可以得到足夠多轉(zhuǎn)化子，如果感受態(tài)效率低或者插入片段長轉(zhuǎn)化子少的情況下可以提高復(fù)蘇時間到30-60 min以得到更多的轉(zhuǎn)化子。

5）取200 μL菌液涂板（含氨芐抗性的LB或SOC固體培養(yǎng)基），培養(yǎng)過夜（如果預(yù)計轉(zhuǎn)化子少，為得到較多克隆，4,000 rpm 離心1 min，吸棄掉部分上清，保留100 μL，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板）。

6）轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定

a. 菌落/菌液PCR鑒定，用無菌的槍頭或牙簽將單個菌落挑至菌落PCR Mix中混勻（如：2×Hieff^® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix (with Dye)，Cat#10157ES），加入引物直接進行PCR反應(yīng)。

b. 質(zhì)粒大小鑒定：挑取單克隆，抽提質(zhì)粒后可根據(jù)質(zhì)粒大小進行鑒定。

c. 酶切鑒定：根據(jù)克隆實驗設(shè)計，選擇合適的限制性內(nèi)切酶進行鑒定。
d. 測序分析：可選測序引物序列如下：

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R：CAGGAAACAGCTATGACC

*本制品陽性率相當(dāng)高，一般情況下，陽性克隆率接近100%，只要是長出來的菌落正常（不是污染的雜菌，轉(zhuǎn)化子數(shù)量也不算太少），基本就是陽性克隆，因此插入片段不超過2-3 kb的情況下可以不用鑒定直接挑1-2個菌去測序。

 

載體圖譜

 

 

 

pESI-blunt vector sequence

ORIGIN

        1 cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct

       61 gctgaagcca gttacctcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc

      121 gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct

      181 caagaagatc ctttgatttt ctaccgaaga aaggcccacc cgtgaaggtg agccagtgag

      241 ttgattgtgt aaaacgacgg ccagtgtctg aggctcgctg cagtcctgaa gcttgatatc

      301 gaattcgcgt gtcgccctta agggcgacac gcgaattcga tatcgcggcc gcctgcagtc

      361 aatactgacg atggtcatag ctgtttcctg tccatagcag aaagtcaaaa gcctccgacc

      421 ggaggctttt gacttgatcg gcacgtaaga ggttccaact ttcaccataa tgaaataaga

      481 tcactaccgg gcgtattttt tgagttatcg agattttcag gagctaagga agctaaaatg

      541 agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt

      601 tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga

      661 gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa

      721 gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt

      781 attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt

      841 gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc

      901 agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga

      961 ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat

     1021 cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct

     1081 gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc

     1141 cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg

     1201 gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc

     1261 ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg

     1321 acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca

     1381 ctgattaagc attggtaatg agggcccaaa tgtaatcacc tggctcacct tcgggtgggc

     1441 ctttctgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat

     1501 cgatgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc

     1561 cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc

     1621 gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt

     1681 tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac

     1741 cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg

     1801 ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca

     1861 gagtt

//

*黃底為多克隆酶切位點序列

Ver.CN20230918