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      首頁(yè) / 干細(xì)胞/類器官 / 產(chǎn)品應(yīng)用詳情

      人肝臟類器官培養(yǎng)手冊(cè)

       

      背景介紹

      肝臟是人體中最大的器官之一,來(lái)源于內(nèi)胚層中前腸上皮細(xì)胞發(fā)育而來(lái)的肝芽結(jié)構(gòu),以代謝功能為主,發(fā)揮“解毒”作用。肝功能失衡會(huì)導(dǎo)致稱為肝衰竭的病理狀況,并導(dǎo)致肝炎、纖維化、肝硬化、癌癥、代謝或自身免疫性疾病。因此,為充分了解每種肝病的表型和損傷器官的機(jī)制,我們需要體外個(gè)性化肝模型系統(tǒng)進(jìn)行疾病建模、藥物發(fā)現(xiàn)和藥物毒性學(xué)習(xí)。

       

      肝臟類器官(hepatic organoids, HLO, HO)是肝臟功能的3D模型,保留了肝細(xì)胞的主要生理特征。在存在或不存在基質(zhì)的情況下,可以從iPSC、ESC或特定的成體細(xì)胞(例如上皮細(xì)胞或上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞)生成類器官。

       

       

      肝臟類器官的培養(yǎng)方案

      我們根據(jù)JCI Insight[1]、Cell Metab[2]和J Hepatol[3]發(fā)表的三篇文章,整理了由人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(human iPSCs)生成肝臟類器官的培養(yǎng)方案。

       

      圖1.iPSC分化為肝類器官的過(guò)程(PMID: 28878125)[1]

       

      A:iPSC分化為肝類器官的示意圖;B-C:在第0天(iPSCs)、第3天(定形內(nèi)胚層,EN)、第6天(前腸,F(xiàn)G)、第9天(成肝細(xì)胞,HB)、第20天(HO1)和第62天(HO2)在HO發(fā)育過(guò)程中發(fā)生的形態(tài)學(xué)和細(xì)胞標(biāo)記變化。

       

       
       
       
      誘導(dǎo)定型內(nèi)胚層

      iPSC在含有5 mM EDTA和10 mM Y-27632的緩沖液解離為單個(gè)細(xì)胞,接種到低吸附的6孔板上,然后用含有激活素A (100 ng/mL)和BMP4 (10 ng/mL)的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)3天;

       

       
       
       
      誘導(dǎo)前腸球體

      更換為含有2% Matrigel和B27的RPMI培養(yǎng)基;第3 -6天,培養(yǎng)基中加入50 ng/mL FGF10;第6-9天,培養(yǎng)基中加入10 ng/mL FGF10和10 ng/mL BMP4;

       

       
       
       
      誘導(dǎo)類器官

      第9天后,更換為含有1% Matrigel、50 ng/mL HGF、50 ng/mL oncostatin M和10 μM Dexamethasone的類器官生長(zhǎng)和分化培養(yǎng)基(HCM)中。

       

       圖2.iPSC分化為肝類器官的過(guò)程(PMID: 31155493)[2]

      A:iPSC分化為肝類器官的示意圖;B:在第0天(iPSCs)和第20天(HLO)明場(chǎng)圖像。

       

       
       
       
      類器官擴(kuò)增

      在第20天收集培養(yǎng)物,將細(xì)胞解離,200 g離心3 min收集細(xì)胞,重懸于50 μL GFR-Matrigel中,接種到24孔板中。Matrigel凝固后,加入1 mL生長(zhǎng)培養(yǎng)基(RPMI-1640, B27, 250 nM LDN-193189, 3 μM CHIR99021, 10 μM A83-01, 100 ng/mL EGF, 10 ng/mL FGF10和20 ng/mL HGF),培養(yǎng)細(xì)胞6天,更換為分化培養(yǎng)基(HCM medium, 10 μM DAPT, 10 ng/mL oncostatin M, 20 ng/mL HGF, 10 μM Dexamethasone, 10 ng/mL BMP4)再培養(yǎng)6天。

       

       

      相關(guān)產(chǎn)品

       

      產(chǎn)品名稱

      產(chǎn)品編號(hào)

      規(guī)格

      簡(jiǎn)介

      Y-27632

      53006ES

      1 mg/5 mg/10 mg

      ROCK抑制劑

      CHIR99021

      53003ES

      2 mg/5 mg/10 mg

      GSK-3α/β抑制劑

      Dexamethasone 地塞米松

      53269ES

      250 mg/500 mg/1 g

      糖皮質(zhì)激素受體激動(dòng)劑

      LDN193189

      53012ES

      5 mg/10 mg

      BMP信號(hào)通路抑制劑

      A 83-01

      53002ES

      1 mg/5 mg/10 mg

      TGF-β信號(hào)抑制劑

      DAPT

      52104ES

      10 mg/50 mg

      Notch通路抑制劑

      human BMP4

      92053ES

      10 μg/100 μg/500 μg

      重組蛋白

      human EGF

      92708ES

      100 μg/500 μg

      重組蛋白

      human Activin A

      91702ES

      10 μg/100 μg/500 μg

      重組蛋白

      human FGF4 

      91303ES

      5 μg/100 μg/500 μg

      重組蛋白

      human FGF10

      91306ES

      5 μg/100 μg/500 μg

      重組蛋白

      human HGF

      92055ES

      10 μg/50 μg/1 mg

      重組蛋白

      human oncostatin M

      92254ES

      10 μg/100 μg/500 μg

      重組蛋白

      N-2 supplement,serum free,100X

      60706ES

      5 mL

      用于細(xì)胞和組織體外培養(yǎng)

      HEPES溶液(1 M),細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)

      60117ES

      100 mL

      化學(xué)緩沖劑

      Sodium Pyruvate丙酮酸鈉

      60370ES

      10 g/100 g

      抗氧化

      BSA牛血清白蛋白,診斷級(jí)別

      36102ES

      25 g/100 g/500 g/1 kg

      用于細(xì)胞培養(yǎng)

      50× B-27無(wú)血清添加劑,去除維生素A

      60704ES

      10 mL

      無(wú)血清添加劑

      Ceturegel® Matrix for Organoid culture,Phenol Red-Free,LDEV-Free 基質(zhì)膠

      40191ES08/10 5mL/10mL 類器官

       

       

      參考文獻(xiàn)

      [1] Guan Y, et al. Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. JCI Insight

      . 2017 Sep 7;2(17):e94954.

      [2] Ouchi R, et al. Modeling Steatohepatitis in Humans with Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids. Cell Metab. 2019 Aug 6;30(2):374-384.e6.

      [3] Mun SJ, et al. Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids. J Hepatol. 2019 Nov;71(5):970-985.

       

      400-6111-883