NGS建庫江湖中，超聲打斷（機(jī)械法）建庫歷來被視為“經(jīng)典大家”。然而酶法片段化，憑借其便捷、經(jīng)濟(jì)、高效的片段化方法，從初出茅廬到力排眾議，一躍成為后起之秀的典范。目前片段化酶法打斷建庫已經(jīng)占有一席之地，但距離攻城略地依然任重道遠(yuǎn)。片段化酶優(yōu)化之路，道阻且長，唯有上下而求索，方能從容而為。
行業(yè)趨勢(shì)-百家爭(zhēng)鳴，百花齊放
對(duì)于dsDNA片段化，超聲打斷堪稱一代宗師。打斷的DNA片段更為集中且無偏好性，是目前NGS建庫中片段化的金標(biāo)準(zhǔn)，但超聲打斷也有其無法克服的局限性，比如：儀器耗材成本居高不下、DNA損傷等也讓競(jìng)爭(zhēng)激烈的NGS下游服務(wù)企業(yè)望而卻步。同時(shí)期亦有勇者不斷涌出，其中片段化酶就是現(xiàn)階段NGS建庫的熱點(diǎn)使用方法。
市面上，片段化酶種類較多，但大都基于內(nèi)切酶原理。對(duì)于不同的片段化酶來說，Tn5依然是NGS市場(chǎng)上極速建庫的王者，但其在建庫中所表現(xiàn)出的偏好性也使得其應(yīng)用頗為局限。因此像DNase Ⅰ、Endonuclease Ⅴ以及Fragmentase等雖在市場(chǎng)上初露鋒芒，但也因其各自的不足尚未被完全開發(fā)利用。而Fragmentase則是目前NGS端最為大眾所熟知的片段化酶。
圖1.不同片段化酶作用原理和優(yōu)劣勢(shì)
革故鼎新，升級(jí)換代
對(duì)于Fragmentase片段化酶，當(dāng)前NGS領(lǐng)域中產(chǎn)品形式上主要分為兩種：片段化試劑（酶+buffer)、片段化/末修/加A一體化模塊。前者產(chǎn)品形式靈活，可滿足不同客戶的需求，而后者使產(chǎn)品操作流程更為精簡(jiǎn)。眾所周知，目前的片段化反應(yīng)上主要是時(shí)間和溫度依賴性，目前已知的商業(yè)化的DNA片段化酶從原理上主要分為兩大類：
基于NEB專利的雙酶片段化體系，由突變體Vvn和突變體T7 endonuclease I組成。
基于隨機(jī)切割DNA的非限制性核酸內(nèi)切酶，比如Dnase I、endonuclease V等或其突變體。
其中，翌圣生物十年匠心，專注于分子工具酶原料的生產(chǎn)和開發(fā)，致力于成為分子酶產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新引領(lǐng)者。憑借雙向酶改造平臺(tái)和自身成熟的分子酶研發(fā)經(jīng)驗(yàn)，經(jīng)過多年的潛心研究與體系優(yōu)化開發(fā)出自身專利的片段化單酶。翌圣專利的片段化酶Smearase主要是非限制性核酸內(nèi)切酶的突變體，單酶體系。酶切效果僅與酶切時(shí)間有關(guān)而與樣本類型GC含量以及Input DNA無關(guān)。此外，受EDTA耐受性較強(qiáng)，已驗(yàn)證可耐受2 mM的EDTA。以此為核心的酶切法建庫試劑盒Hieff NGS? OnePotⅡ DNA Library Prep Kit for Illumina?&MGI?擺脫了繁瑣的超聲過程，同時(shí)簡(jiǎn)化了操作流程，極大的降低了建庫的時(shí)間和成本，并且針對(duì)FFPE樣本、WGA產(chǎn)物和長擴(kuò)增子等復(fù)雜樣本也能獲得優(yōu)異的測(cè)序結(jié)果。
圖2. YEASEN片段化酶耐受2 mM EDTA打斷效果
（1×TE buffer酶切體系EDTA額外添加0.375 mM(1.125 mM），30度酶切8 min主帶無明顯變化）
但是在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，針對(duì)不同的樣本類型或不同的提取試劑盒采用相同的打斷時(shí)間往往無法獲得一致的打斷結(jié)果，有時(shí)需要針對(duì)個(gè)別樣本額外調(diào)整打斷時(shí)間。因此，翌生生物一直致力于開發(fā)出高質(zhì)量片段化酶可同時(shí)兼容市場(chǎng)不同的需求。最終經(jīng)過特殊優(yōu)化，篩選出更高質(zhì)量的新片段化酶-OnePot Pro系列，同時(shí)打斷體系中對(duì)部分溶解體系中額外添加Conditioning Solution可進(jìn)一步平衡反應(yīng)體系，對(duì)于不同的樣本類型可在統(tǒng)一的打斷條件下反應(yīng)。而且OnePot Pro系列片段化酶建庫后測(cè)序數(shù)據(jù)顯示打斷的偏好性更低，無GC bias等，可進(jìn)一步滿足市場(chǎng)的不同需求。
圖3. 不同DNA buffer（H2O、TE、EB和AE），相同打斷時(shí)間，搭配TE均一化后基本一致
圖4. OnePot Pro片段化酶打斷后測(cè)序質(zhì)量分析顯示極低偏好性
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