克隆的那些事(上)
克隆，一個(gè)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)都繞不開(kāi)的步驟，一個(gè)實(shí)驗(yàn)室入門必備技能。但很多剛?cè)腴T的學(xué)弟學(xué)妹反映克隆就像一門玄學(xué)，時(shí)靈時(shí)不靈，這是為什么呢？
今天，小翌就帶大家好好盤一盤這個(gè)克隆里的門道。
克隆第一步：制備線性化載體
首先需要抽提質(zhì)粒，質(zhì)粒抽提的方法主要分為乙醇沉淀法和柱提法。質(zhì)粒提取之后我們可以電泳檢測(cè)抽提質(zhì)粒的質(zhì)量是否合格？抽提出來(lái)的質(zhì)粒一般可以看到三條帶：開(kāi)環(huán)質(zhì)粒、環(huán)狀質(zhì)粒和超螺旋質(zhì)粒（如圖1A）。除此之外，還可以采用紫外分光光度計(jì)對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)，理論認(rèn)為測(cè)出的質(zhì)粒DNA的OD260/OD280若在1.6-1.8之間，較為純凈，若＜1.6，表明有蛋白質(zhì)、酚等污染，需要進(jìn)一步純化，以免影響后續(xù)酶切反應(yīng)。
接下來(lái)就是載體的線性化，線性化載體的制備大致分為質(zhì)粒酶切和反向PCR擴(kuò)增兩種，常用的方法為酶切制備線性化載體。良好的線性化載體條帶是單一的，往往比超螺旋質(zhì)粒的位置靠后（如圖1A）。那么，如果遇見(jiàn)線性化載體電泳條帶彌散（圖1B）的情況，該如何處理呢？
圖1.質(zhì)粒圖譜
注：A：酶切完全的質(zhì)粒圖譜（單酶切）；B：線性化不完全的質(zhì)粒
若實(shí)驗(yàn)中線性化質(zhì)粒出現(xiàn)多個(gè)條帶或條帶彌散（如圖1B），首先需要考慮一下酶切時(shí)間是否過(guò)長(zhǎng)從而導(dǎo)致出現(xiàn)了星星活性，或酶切體系中出現(xiàn)阻遏物。面對(duì)此類情況，首先我們要檢查一下我們的酶切體系配置的是否合理，反應(yīng)條件是否按照說(shuō)明書進(jìn)行。此處值得注意的是，質(zhì)粒載體的投入量不宜過(guò)多，過(guò)多會(huì)導(dǎo)致線性化不完全，同時(shí)加入的酶量不可超過(guò)反應(yīng)體系的1/10，酶切反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)容易出現(xiàn)星活性，切出拖帶。
反向PCR制備線性化載體，原理如下圖所示。反向PCR的引物方向與常規(guī)PCR相反，但其設(shè)計(jì)原則與常規(guī)PCR相同。這種方法常常用來(lái)在載體中引入突變。使用反向PCR制備線性化載體時(shí)，需要使用高保真酶進(jìn)行擴(kuò)增，避免由于長(zhǎng)片段擴(kuò)增帶來(lái)的點(diǎn)突變等問(wèn)題。
圖2.反向PCR制備線性化載體
反向PCR需要注意擴(kuò)增的產(chǎn)物需要條帶單一，若電泳出現(xiàn)非特異性條帶則需要通過(guò)膠回收切下大小正確的條帶?？赏ㄟ^(guò)調(diào)整PCR的退火溫度，提高PCR產(chǎn)物的特異性。同時(shí)，建議加入DpnI酶進(jìn)行質(zhì)粒模板降解（模板最好來(lái)自甲基化功能未損傷的菌株），從而提高克隆的陽(yáng)性率。
克隆第二步：準(zhǔn)備插入片段
許多剛?cè)腴T的學(xué)弟學(xué)妹在設(shè)計(jì)引物這一關(guān)就遇到了攔路虎。那么引物該怎么設(shè)計(jì)？一步法快速克隆的原理從本質(zhì)上來(lái)講是同源重組，需要在插入片段的兩端加上同源臂，同源臂的長(zhǎng)度一般為18-25bp之間。設(shè)計(jì)出來(lái)的引物需要包含兩部分：一部分是用來(lái)擴(kuò)增目的片段；一部分是用來(lái)與載體退火的同源臂。設(shè)計(jì)出來(lái)的引物要遵循引物設(shè)計(jì)原則：
引物長(zhǎng)度：用來(lái)擴(kuò)增目的片段的那部分一般在15~30bp之間，同源臂部分一般在18~25bp之間；
引物GC含量：GC含量一般在40-60%之間，過(guò)高或者過(guò)低都不利于反應(yīng)。
避免引物出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)：設(shè)計(jì)引物要避免出現(xiàn)發(fā)卡結(jié)構(gòu)，我們可用DNAMAN對(duì)引物二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。
多片段同源臂設(shè)計(jì)注意事項(xiàng)：在進(jìn)行多片段引物設(shè)計(jì)時(shí)，一般需要保證多片段之間的同源臂一般在15bp左右，在目的片段擴(kuò)增段，則遵循上述的PCR擴(kuò)增注意事項(xiàng)。
圖3.同源重組流程圖
設(shè)計(jì)好引物之后接下來(lái)就是PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增，通常情況下，短片段（<1000bp）的克隆是較容易成功的，長(zhǎng)片段的同源重組克隆就相對(duì)困難。在擴(kuò)增長(zhǎng)片段的目的DNA時(shí)，最好優(yōu)先選擇高保真酶，避免擴(kuò)增出來(lái)的片段出現(xiàn)堿基的缺失或改變，試想一下好不容易挑了一堆克隆，就一個(gè)陽(yáng)性，一測(cè)序發(fā)現(xiàn)堿基錯(cuò)了，氨基酸都變了，豈不是腸子都悔青了。
擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物需要通過(guò)電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否特異。好的PCR產(chǎn)物是單一且亮的條帶（圖4A）。那PCR擴(kuò)增的片段出現(xiàn)非特異性條帶（如圖4B），該如何解決呢？
圖4.PCR產(chǎn)物電泳圖
注：A：特異性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物電泳；B：非特異性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物電泳
如果PCR產(chǎn)物出現(xiàn)（圖4B）中的非特異性擴(kuò)增條帶?？梢試L試通過(guò)凝膠電泳將條帶跑開(kāi)，然后將目的大小的條帶進(jìn)行切膠回收。除此之外，可以適當(dāng)提高退火溫度從而提高PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。如果擴(kuò)增出來(lái)得PCR產(chǎn)物目的條帶十分微弱，可以將PCR產(chǎn)物取0.1 µL作為模板嘗試進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物推薦通過(guò)膠回收進(jìn)行純化以備后續(xù)酶連。
以上就是線性化載體的制備以及插入片段的制備問(wèn)題，至于酶連和轉(zhuǎn)化遇到的問(wèn)題，我們下期再論。
相關(guān)產(chǎn)品
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產(chǎn)品定位 |
產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品貨號(hào) |
規(guī)格 |
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單片段一步克隆 |
10911ES20 |
20T |
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1-5片段一步克隆 |
10912ES10 |
10T |
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1-6片段一步克隆 |
10922ES20 |
20T |
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替代TA連接克隆 |
10907ES20 |
20T |
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替代TA連接克隆 |
Hieff Clone® Zero TOPO-TA Simple Cloning Kit, MCS-Depleted 零背景TOPO-TA克隆試劑盒（不含MCS多克隆酶切位點(diǎn)） |
10908ES20 |
20T |
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替代平末端連接克隆 |
Hieff Clone® Zero TOPO-Blunt Cloning Kit 零背景TOPO-Blunt平末端克隆試劑盒 |
10909ES20 |
20T |
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替代平末端連接克隆 |
Hieff Clone® Zero TOPO-Blunt Simple Cloning Kit 零背景TOPO-Blunt平末端克隆試劑盒（不含MCS多克隆酶切位點(diǎn)） |
10910ES20 |
20T |
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DNA克隆和質(zhì)粒擴(kuò)增 |
11801ES80 |
10×100 μL |
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DNA克隆和質(zhì)粒擴(kuò)增 |
11802ES80 |
10×100 μL |
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非病毒蛋白重組表達(dá) |
BL21 (DE3) Chemically Competent Cell BL21 (DE3)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞 |
11804ES80 |
10×100 μL |
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常規(guī)PCR擴(kuò)增 |
10102ES03 |
1mL |
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快速PCR擴(kuò)增 |
10157ES03 |
1mL |
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高保真PCR |
10154ES01 |
100 μL |
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柱式法核酸提取 |
19001ES50 |
50T |
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柱式法核酸提取 |
MolPure® Endo-free Plasmid Mini Kit 無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒 |
19021ES50 |
50T |
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柱式法核酸提取 |
MolPure® Endo-free Plasmid Maxi Kit無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒 |
19036ES10 |
10T |
|
柱式法核酸提取 |
19101ES50 |
50T |
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柱式法核酸提取 |
19106ES50 |
50T |
點(diǎn)擊產(chǎn)品名稱查看詳情
