PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，體系中加入dNTP、Mg2+以及延伸因子、擴增增強因子，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程，能快速特異地在體外擴增任何目的DNA。

圖1. PCR擴增流程

常規(guī)PCR的擴增開始時間并不是放進(jìn)PCR儀，運轉(zhuǎn)程序才開始擴增。當(dāng)體系配置完成的時候，擴增就開始了，這可能會引起非特異性擴增出現(xiàn)，熱啟動PCR可以解決這一問題。什么是熱啟動PCR？當(dāng)反應(yīng)體系配制好后，在反應(yīng)初始加熱階段或“熱啟動”階段，酶修飾物在高溫下（通常高于90 ℃）被釋放，使得DNA聚合酶被激活。具體激活時間和溫度取決于DNA聚合酶以及熱啟動修飾物的性質(zhì)。該方法主要利用抗體、親合配體、或化學(xué)修飾物等修飾物，來抑制的DNA聚合酶的活性。由于DNA聚合酶在常溫下的活性被抑制，熱啟動技術(shù)為在常溫下配制多個PCR反應(yīng)體系提供了極大的便利，且無需犧牲PCR反應(yīng)的特異性。

圖2. 基于抗體熱啟動技術(shù)的DNA聚合酶

逆轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse Transcription PCR，RT-PCR)，是從mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并以此為模板進(jìn)行擴增的一種實驗技術(shù)。實驗流程是先提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以O(shè)ligo（dT）為引物，利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達(dá)。

注：oligo(dT)是由數(shù)量少于20的脫氧胸苷酸連接而成的核苷酸鏈，它可以特異性地結(jié)合到mRNA的poly(A)尾端(多A尾)，從而使逆轉(zhuǎn)錄酶只能逆轉(zhuǎn)錄含有poly(A)尾的mRNA。

圖3. 逆轉(zhuǎn)錄PCR原理

熒光定量PCR（Real-time Quantitative PCR，RT-qPCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對模板進(jìn)行定量分析的方法。常用的qPCR方法有熒光染料法（SYBR Green I）和探針法（TaqMan）。染料法（常用SYBR Green Ⅰ）：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，沒有摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。探針法（常用TaqMan探針）：探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。

圖4. 染料法原理

圖5. 探針法原理

巢式PCR（Nested PCR）是指利用兩套PCR引物進(jìn)行兩輪PCR擴增，第二輪的擴增產(chǎn)物才是目的基因片段。如果第一對引物（外引物）的錯配導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物被擴增，相同的非特異性區(qū)域被第二對引物識別并繼續(xù)擴增的可能性非常小，所以通過第二對引物的擴增，PCR的特異性得到了提升。進(jìn)行兩輪PCR的一個優(yōu)勢在于：有助于從有限的起始DNA中擴增得到足量的產(chǎn)物。巢式PCR的實驗原理為根據(jù)DNA模板序列設(shè)計兩對引物，利用第一對引物（稱為外引物）對靶DNA進(jìn)行15-30個循環(huán)的標(biāo)準(zhǔn)擴增；第一輪擴增結(jié)束后將一小部分起始擴增產(chǎn)物稀釋100-1000倍加入到第二輪擴增體系中作為模板，利用第二對引物（稱為內(nèi)引物或巢式引物，結(jié)合在第一輪PCR產(chǎn)物的內(nèi)部，進(jìn)行15-30個循環(huán)的擴增，第二輪PCR的擴增片段短于第一輪。

圖6. 巢式PCR原理

降落PCR（Touchdown PCR）是一種通過調(diào)整PCR循環(huán)參數(shù)，提升PCR反應(yīng)特異性的方法。在降落PCR中，前幾個循環(huán)的退火溫度設(shè)定為，比引物的最高退火溫度（Tm）再高幾度。較高的退火溫度能有效減少非特異性擴增，但同時較高的退火溫度會加劇引物與目標(biāo)序列的分離，導(dǎo)致PCR的產(chǎn)量降低。因此在開始的幾個循環(huán)中，退火溫度通常設(shè)置為每個循環(huán)降低1℃，以增加體系中目的基因的含量。當(dāng)退火溫度降低到最佳溫度時，剩余循環(huán)都維持此退火溫度。通過這種方法，在PCR過程中，所期望的PCR產(chǎn)物得到有選擇性的增加，而幾乎不會出現(xiàn)非特異性的產(chǎn)物。

圖7. 降落PCR

注：通過以較高的溫度起始，再隨著循環(huán)逐漸降低到最佳退火溫度（黑色曲線），這種PCR方法可提升反應(yīng)特異性（黃色曲線）。目標(biāo)擴增子的產(chǎn)量（綠色曲線）相應(yīng)的得到富集。

直接PCR是指直接從樣品擴增目標(biāo)DNA，無需進(jìn)行核酸分離純化。直接PCR分兩類，直接法：取少量樣本直接加入到PCR Master Mix中，進(jìn)行PCR鑒定；裂解法：樣本取樣后，加入裂解液中，裂解釋放基因組，取少量裂解上清液加入到PCR Master Mix中，進(jìn)行PCR鑒定。這種方法簡化了實驗流程，減少了動手操作時間，同時可避免純化步驟DNA的損失。

推薦具有高合成能力的DNA聚合酶用于直接PCR擴增。細(xì)胞碎片、蛋白、脂質(zhì)和多糖也隨DNA釋放到裂解液中，它們會抑制PCR反應(yīng)。具有高合成能力的DNA聚合酶可以耐受這些抑制劑，從而使直接PCR成為可能。具有高合成能力的聚合酶通常具有更高靈敏度，因此可從未純化樣本中擴增微量的DNA。

圖8. 直接PCR示意圖

重疊延伸PCR技術(shù) (gene splicing by overlap extension PCR，SOE PCR)，是采用具有互補末端的引物，使 PCR 產(chǎn)物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴增片段重疊拼接起來的技術(shù)。這項技術(shù)目前主要有兩個應(yīng)用方向：構(gòu)建融合基因；基因定點突變。

圖9.重疊延伸PCR技術(shù)用于構(gòu)建融合基因的原理

圖10. 重疊延伸PCR技術(shù)用于基因定點突變的原理

反向PCR （Inverse PCR, IPCR）是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的DNA片段，對某個已知DNA片段兩側(cè)的末知序列進(jìn)行擴增。反向PCR設(shè)計之初是為了用于確定鄰近未知區(qū)域的序列，多用于研究基因的啟動子序列；致癌性染色體重排，如基因融合、易位和轉(zhuǎn)座；以及病毒基因整合，現(xiàn)在也常用于定點突變，復(fù)制一個具有預(yù)期突變的質(zhì)粒。反向PCR流程，首先對模板進(jìn)行限制性酶切消化和連接，選定的限制性內(nèi)切酶不可剪切已知序列，從而使連接發(fā)生于側(cè)翼未知序列之間。使用低濃度的酶切DNA片段優(yōu)化連接步驟，使其傾向于自我連接而非多片段連接（即形成連環(huán)體）。完成自我連接后，從DNA的已知區(qū)域啟動反向PCR。所獲得的擴增子每個末端都含有部分已知DNA序列。隨后，對這些擴增子進(jìn)行測序，檢測上述已知序列的相鄰區(qū)域。

圖11. 使用反向PCR來擴增和鑒定臨近未知區(qū)域序列

數(shù)字PCR（Digital PCR，dPCR）是一種核酸分子絕對定量技術(shù)。當(dāng)前核酸分子的定量有三種方法，光度法基于核酸分子的吸光度來定量；實時熒光定量PCR（Real Time PCR）基于Ct值，Ct值就是指可以檢測到熒光值對應(yīng)的循環(huán)數(shù)；數(shù)字PCR是最新的定量技術(shù)，基于單分子PCR方法來進(jìn)行計數(shù)的核酸定量，是一種絕對定量的方法。主要采用當(dāng)前分析化學(xué)熱門研究領(lǐng)域的微流控或微滴化方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器或微滴中，每個反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個。這樣經(jīng)過PCR循環(huán)之后，有一個核酸分子模板的反應(yīng)器就會給出熒光信號，沒有模板的反應(yīng)器就沒有熒光信號。根據(jù)相對比例和反應(yīng)器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。除了基因表達(dá)和拷貝數(shù)檢測，數(shù)字PCR也適用于諸如低頻等位基因的辨別、病毒滴定和二代測序文庫的絕對定量。

圖12. 數(shù)字PCR流程

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