Blood Advanced Direct PCR Kit是一款可直接對全血樣本進(jìn)行PCR擴增而無需進(jìn)行DNA純化或樣本預(yù)處理的試劑盒，兼容含EDTA、肝素、檸檬酸鹽等常規(guī)抗凝劑的新鮮血液、冷藏（凍）血液及Whatman903^®和FTA^®商用干血漬。試劑盒中含有經(jīng)過經(jīng)基因工程改造的DNA Polymerase組合，具有保真性高、對PCR抑制劑耐受性強的特點，2× Hieff^® Blood Advanced PCR Buffer中添加強力延伸因子、擴增增強因子以及優(yōu)化的緩沖體系，能夠在快速延伸條件下高效擴增8 kb的基因組片段，對于2 kb以下的片段，設(shè)置3-5 sec/kb延伸時間即可完成擴增，從而大幅縮短血液樣本的鑒定及檢測時間。

       Hieff^® Advanced High-Fidelity DNA Polymerase Mix的擴增產(chǎn)物的3’端為平末端，適用于一步法快速克隆及TOPO克隆試劑盒（Yeasen CAT# 10907/10908/10909/10910/10911/10912/10922）。
  試劑盒中提供的引物預(yù)混液Positive control primer mix (10 μM each)能夠從哺乳動物和大多數(shù)脊椎動物的sox21基因上游保守序列中擴增出長度237 bp的片段，可作為陽性對照使用。

 

產(chǎn)品組分

編號	名稱	10188ES20	10188ES50	10188ES60	10188ES76
10188-A	2× Hieff® Blood Advanced PCR Buffer	500 μL	1.25 mL	2.5 mL	12.5 mL
10188-B	Hieff® Advanced High-Fidelity DNA Polymerase Mix	20 μL	50 μL	100 μL	500 μL
10188-C	Positive control primer mix (10 μM each)	100 μL	100 μL	200 μL	500 μL
10188-D	10× DNA loading buffer	1 mL	1 mL	1 mL	1 mL × 5

 

運輸與保存方式

干冰運輸。-20℃保存，有效期1年。

 

適用范圍

不同類型的全血樣本直接PCR反應(yīng)。

 

注意事項

1. 推薦血液模板使用量為反應(yīng)總體積的10%，即50 μL反應(yīng)體系中加入5 μL全血作為模板，注意避免吸取血液凝塊。
2. 延伸時間10 sec/kb可擴增8 kb以下大部分目的片段，3-5 sec/kb即可擴增大部分2 kb以下片段。若擴增效率較低，可適當(dāng)延長時間至30 sec/kb。
3. PCR反應(yīng)結(jié)束后，推薦將反應(yīng)產(chǎn)物于4000 rpm (1000× g) 離心1-3 min以沉淀血細(xì)胞碎片，取上清進(jìn)行下游分析。
4. 本產(chǎn)品不可直接用于醫(yī)療診斷。
5. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。

 

PCR反應(yīng)體系^a

組分	體積
ddH2O	to 50 μL
2× Hieff® Blood Advanced PCR Buffer	25 μL
Forward Primer (10 μM) b	2 μL
Reverse Primer (10 μM) b	2 μL
Hieff® Advanced High-Fidelity DNA Polymerase Mix	1 μL
血液樣本c	X

^a 使用前請充分混勻各組分。

^b 推薦每條引物的使用終濃度為0.4 μM，過高會導(dǎo)致非特異性擴增。

^c 最佳全血模板濃度范圍為0.5%-20%，推薦使用量為10%作為初始嘗試條件，即50 μL反應(yīng)體系中加入5 μL全血作為模板，注意避免吸取血液凝塊。對于貯存在Whatman^®濾紙卡上的干血漬，則可取約1 mm²帶血漬的圓紙片，無需進(jìn)行預(yù)處理，直接放入PCR反應(yīng)液中即可進(jìn)行擴增。

PCR反應(yīng)條件

循環(huán)步驟	溫度	時間	循環(huán)數(shù)
預(yù)變性	95℃	5 min	1
變性	95℃	15 sec	30-35
退火a	60℃	15 sec
延伸b	72℃	3-10 sec/kb
終延伸	72℃	5 min	1

^a 退火溫度為通用Tm值或低于引物Tm值1-2℃。如果擴增產(chǎn)物特異性較差，可以建立退火溫度梯度以尋找最佳退火條件。

^b 延伸時間10 sec/kb可擴增8 kb以下大部分目的片段，3-5 sec/kb即可擴增大部分2 kb以下片段。若擴增效率較低，可適當(dāng)延長時間至20-30 sec/kb，不應(yīng)超過60 sec/kb。

PCR產(chǎn)物分析
PCR反應(yīng)結(jié)束后，推薦將反應(yīng)產(chǎn)物于4000 rpm (1000× g) 離心1-3 min以沉淀血細(xì)胞碎片，取上清進(jìn)行下游分析。該步驟可消除全血中多種殘留成分對電泳檢測的干擾，對使用高濃度血液作為模板的PCR產(chǎn)物尤為必要。通常，5 μL/50 μL (10%)反應(yīng)產(chǎn)物可取30-35 μL上清，3 μL/50 μL (5%)反應(yīng)產(chǎn)物可取40-45 μL上清。若需對PCR產(chǎn)物進(jìn)行其它分析，例如酶切等，應(yīng)將產(chǎn)物稀釋2-4倍以降低反應(yīng)中的鹽及其它抑制劑對反應(yīng)的干擾。

對照反應(yīng)
試劑盒內(nèi)提供引物預(yù)混液Positive Control Primer Mix (10 μM each) 用于陽性對照反應(yīng)?？蓮牟溉閯游锛捌渌S多脊椎動物的基因組sox 21基因上游序列中擴增出237 bp的片段，該擴增區(qū)是一段高度保守的非編碼區(qū)。
Primer F: 5'- AGCCCTTGGGGASTTGAATTGCTG -3'   
Primer R: 5'- GCACTCCAGAGGACAGCRGTGTCAATA -3'

 

常見問題與解決方案

無擴增產(chǎn)物或產(chǎn)量少	產(chǎn)物呈現(xiàn)高分子量彌散條帶	產(chǎn)物呈現(xiàn)低分子量彌散條帶
檢查引物設(shè)計，確認(rèn)引物濃度和純度	提高退火溫度或設(shè)置退火梯度	電泳前離心取上清
重復(fù)實驗，確認(rèn)體系、程序無誤	延伸時間不應(yīng)過長	提高退火溫度或設(shè)置退火梯度
增加循環(huán)數(shù)	嘗試不同的血液用量	嘗試不同的血液用量
優(yōu)化退火溫度	減少循環(huán)數(shù)	減少循環(huán)數(shù)
嘗試不同的血液用量	降低引物濃度	降低引物濃度
重新設(shè)計引物		重新設(shè)計引物

HB220617