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      漲知識(shí)|克隆專題二：不同分子克隆方法介紹(下)
       
       
      


      

      

      

      

      

      

      克隆是英文“clone”或“cloning”的音譯，而英文“clone”則起源于希臘文“Klone”，原意是指以幼苗或嫩枝插條。1963年J.B.S.Haldane在題為“人類種族在未來(lái)二萬(wàn)年的生物可能性”的演講上采用“克?。–lone）”的術(shù)語(yǔ)，把“克隆技術(shù)”帶到了人們的視野中。
      


       
      


      克隆技術(shù)又稱為“生物放大技術(shù)”，目前應(yīng)用最廣泛的技術(shù)為“分子克隆”，又稱重組DNA技術(shù)，即通過(guò)重組技術(shù)將目的DNA片段按照人們的設(shè)計(jì)定向連接起來(lái)，在特定的受體細(xì)胞中與載體同時(shí)復(fù)制并得到表達(dá)，產(chǎn)生新的遺傳性狀的技術(shù)。
      


       
      


      之前小翌給小伙伴們介紹了常規(guī)的分子克隆方法，接下來(lái)繼續(xù)帶領(lǐng)大家認(rèn)識(shí)一下新的、非常規(guī)的分子克隆技術(shù)，包括無(wú)縫克隆中的Golden Gate技術(shù)、Gateway技術(shù)、不依賴基因序列和連接反應(yīng)的克隆方法等等。
      

      

      

      

      


       
      

      


      

      

       
      

      

      


      

      

      

      01
      


      

      Golden Gate技術(shù)
      

      

      

      

      


      

      Golden Gate克隆在2008年由Engler等人提出，是依賴IIS型限制酶的無(wú)縫克隆技術(shù)，能媲美Gibson Assembly，主要用于多片段克隆組裝。實(shí)驗(yàn)步驟與傳統(tǒng)克隆技術(shù)相似，但限制性內(nèi)切酶酶切原理不同。傳統(tǒng)酶切使用的TypeII型限制性內(nèi)切酶通常識(shí)別4-8 bp的回文序列，并在識(shí)別序列內(nèi)部切割產(chǎn)生粘性末端或平末端。
      



      
Golden Gate克隆技術(shù)通過(guò)TypeIIS型限制性內(nèi)切酶（翌圣BsmBI Cat#15203ES、BspQI限制性內(nèi)切酶Cat#15202ES、FuniCut™ BsaI Cat#15005ES）識(shí)別目的序列以外的四個(gè)堿基，剪切后獲得粘性末端，直接用于目的片段的連接。通過(guò)連接酶（翌圣T4 DNA連接酶Cat#10300）連接形成重組質(zhì)粒，使用轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，由于限制性內(nèi)切酶的特性，酶切連接后酶切位點(diǎn)不再存在，能達(dá)到精確的無(wú)縫克隆。Engler等人利用該技術(shù)成功連接了9個(gè)目的片段，連接率達(dá)90%以上。
      

      


      

      


      圖1. Golden Gate Assembly克隆原理示意圖【1】
      


       
      


      

      

      

      02
      


      

      Gateway技術(shù)
      

      

      

      

      


      Gateway技術(shù)最早在1990s年被發(fā)現(xiàn)應(yīng)用，主要用于表達(dá)載體、RNAi干擾載體等載體的構(gòu)建。其原理利用噬菌體的特性：即噬菌體DNA會(huì)定點(diǎn)整合到細(xì)菌宿主基因組上?？茖W(xué)家們研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體和細(xì)菌內(nèi)均含有重組位點(diǎn)attP和attB，能有效幫助噬菌體入侵宿主細(xì)胞，從而將噬菌體DNA插入到細(xì)菌基因組上，同時(shí)在重組位點(diǎn)上產(chǎn)生兩個(gè)新位點(diǎn)：attL和attR，該過(guò)程可逆。
      


      

       
      

      


      Gateway構(gòu)建表達(dá)載體實(shí)驗(yàn)流程如下圖：
      


       
      


      


      圖2. Gateway技術(shù)構(gòu)建表達(dá)載體【2】
      

      


      

       
      


      此技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于利用位點(diǎn)特異重組成入門載體后，不再受到酶切位點(diǎn)和連接酶的限制，可以多次轉(zhuǎn)移到其他載體上。再加上供體載體含有ccdB致死基因，會(huì)殺死重組不成功的質(zhì)粒，所以陽(yáng)性克隆率高，但受控于存在的介導(dǎo)蛋白和重組位點(diǎn)。此外，需要注意的一點(diǎn)是，進(jìn)行重組反應(yīng)時(shí)需要使用對(duì)CcdB敏感的大腸桿菌菌株，如翌圣DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞（Cat#11802ES）、翌圣TOP10化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞（Cat#11801ES），能抑制大腸桿菌菌株的生長(zhǎng)繁殖，進(jìn)行負(fù)篩。
      


       
      


      

      

      

      03
      


      

      不依賴基因序列和連接反應(yīng)的克隆方法（SLIC）
      

      

      

      

      


      2007年，來(lái)自于哈佛醫(yī)學(xué)院的Li等人建立了不依賴序列和連接的克隆方法（Sequence and ligation-independent cloning，SLIC）。SLIC方法不受目的序列和連接反應(yīng)的限制，能將任意、多個(gè)DNA片段組裝起來(lái)，在體外完成重組反應(yīng)，用途非常廣泛。
      

      


      

       
      


      基本操作流程如下：
      

      


      

      

      

      

       
      

      


      

      

      

      

      

      01
      

      


       
      

      


      PCR擴(kuò)增目的片段，在片段兩端分別加上15-30 bp的同源序列；
      

      

      


      

      

      

      

      02
      

      


       
      

      


      利用T4 DNA聚合酶的3'-5'外切酶活性，在22℃條件下消化DNA片段，產(chǎn)生含有同源序列的5'-ssDNA突出端。突出端長(zhǎng)度可通過(guò)dCTP控制；
      

      

      


      

      

      

      

      03
      

      


       
      

      


      將處理后的目的片段置于T4 DNA連接緩沖液中，于37℃完成突出單鏈的復(fù)性重組，形成含有缺口的環(huán)狀中間體，直接轉(zhuǎn)化細(xì)胞；
      

      

      


      

      

      

      

      04
      

      


       
      

      


      利用大腸桿菌自身的修復(fù)系統(tǒng)使其形成完整的環(huán)狀質(zhì)粒。
      

      

      

      

      

      

      


      

       
      


      


      圖3. SLIC法構(gòu)建表達(dá)載體的步驟【3】
      

      


      

       
      


      

      

      

      04
      


      

      細(xì)胞裂解物體外無(wú)痕連接
      

      

      

      

      


      細(xì)胞裂解物體外無(wú)痕連接（SLiCE）是利用細(xì)胞裂解物而進(jìn)行體外無(wú)痕組裝DNA的方法，能一步組裝多個(gè)目的片段。它在2012年由Zhang等人提出，在2013年由Fisher等人進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)，擴(kuò)增了可用于該技術(shù)的細(xì)胞裂解物，此外，Itaya等人發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌本身就具有可用于片段組裝的同源重組系統(tǒng)，進(jìn)一步擴(kuò)展了可用的細(xì)胞裂解物來(lái)源。相比于其他不依賴限制性內(nèi)切酶和連接酶的技術(shù)，SLiCE方法使用的細(xì)胞裂解物更易獲得和保存，實(shí)驗(yàn)成本更低，適用于大多數(shù)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室。
      



      
其具體的操作步驟是，利用PCR技術(shù)在目的片段兩側(cè)分別加上20-25 bp的同源序列，用DpnI酶（翌圣FuniCut™ DpnI Cat#15052ES）消化處理，組裝片段按合適的比例混勻，加入大腸桿菌細(xì)胞裂解物，37℃反應(yīng)1 h，然后直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，即可實(shí)現(xiàn)體外無(wú)痕組裝DNA。
      

      


      

       
      


      


      圖4. SLiCE技術(shù)【4】
      

      


      

       
      


      通過(guò)上述兩篇專題，小翌介紹了一些傳統(tǒng)的、應(yīng)用范圍廣的、新型的分子克隆方法，希望對(duì)各位科研er們的日常實(shí)驗(yàn)有所幫助和啟發(fā)。隨著近幾年基因編輯技術(shù)、合成生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，分子克隆技術(shù)越來(lái)越趨于高效化、多樣化，其中的每一項(xiàng)內(nèi)容都值得我們?nèi)ヌ骄?。關(guān)注我們，小翌會(huì)在下一期的分子克隆技術(shù)專題中給大家具體講解分子克隆技術(shù)中應(yīng)用到那些技術(shù)，為您的實(shí)驗(yàn)帶來(lái)新的思路與方向，期待下一次的見(jiàn)面~
      

      


      

       
      


      

      

      

      05
      


      

      相關(guān)產(chǎn)品列表
      

      

      

      

      


       
      


      
	
		
      
			
			
      產(chǎn)品定位
      
			      		
			
			
      產(chǎn)品名稱
      
			      		
			
			
      產(chǎn)品貨號(hào)
      
			      		
			
			
      規(guī)格
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      Golden Gate組裝 
      
			      		
			
			
      BspQI限制性內(nèi)切酶 (10 U/μL) 
      
			      		
			
			
      15202ES76 
      
			      		
			
			
      500 U 
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      Golden Gate組裝 
      
			      		
			
			
      BsmBI（10 U/μL） 
      
			      		
			
			
      15203ES80 
      
			      		
			
			
      1000 U 
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      通用緩沖液，5min完成精準(zhǔn)酶切 
      
			      		
			
			
      FuniCut™快速限制性內(nèi)切酶 
      
			      		
			
			
      15001ES-15051ES 
      
			      		
			
			
      50 T 
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      T4連接 
      
			      		
			
			
      Hieff® Gold T4 DNA Ligase 
      
			      		
			
			
      10300ES80 
      
			      		
			
			
      1000 U 
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      5 min快速完成感受態(tài)轉(zhuǎn)化 
      
			      		
			
			
      F DH5α化學(xué)感受態(tài) 
      
			      		
			
			
      11803ES80 
      
			      		
			
			
      10×100 μL
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      常規(guī)化學(xué)感受態(tài) 
      
			      		
			
			
      DH5α 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞 
      
			      		
			
			
      11802ES80 
      
			      		
			
			
      10×100 μL 
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      常規(guī)化學(xué)感受態(tài) 
      
			      		
			
			
      TOP10化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞 
      
			      		
			
			
      11801ES80 
      
			      		
			
			
      10×100 μL 
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      常規(guī)PCR 
      
			      		
			
			
      2×Hieff® PCR Master Mix(With Dye) 
      
			      		
			
			
      10102ES03/08 
      
			      		
			
			
      1 mL/5×1 mL 
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      常規(guī)PCR，不含染料 
      
			      		
			
			
      2×Hieff® PCR Master Mix(No Dye) 
      
			      		
			
			
      10103ES03/08 
      
			      		
			
			
      1 mL/5×1 mL 
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      快速PCR，快至1s/kb 
      
			      		
			
			
      2×Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix(with Dye) 
      
			      		
			
			
      10157ES03/08 
      
			      		
			
			
      1 mL/5×1 mL 
      
			      		
		
      
	      

      


       
      

      


      

       
      


      

      

      

      06
      


      

      參考文獻(xiàn)
      

      

      

      

      


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2.林春晶, 韋正乙, 蔡勤安等. 幾種植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法[J].生物技術(shù), 2008(05): 84-87.
      
3.張陽(yáng)璞, 楊淑慎. 幾種新型植物基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法[J].生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(03): 311-327.
      
4.楊發(fā)譽(yù), 楊云彭, 霍毅欣. 合成生物學(xué)中不依賴限制性內(nèi)切酶的分子克隆策略[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 2018, 34(04): 364-370.
      

      

      


       
      


      


       
      

       
       
       
       
       
       
       
      400-6111-883