干貨滿滿|常用細(xì)胞凋亡常用檢測(cè)方法
細(xì)胞凋亡（Apoptosis）是一種有序的或者程序性的細(xì)胞死亡方式，是細(xì)胞受到特定基因調(diào)控后的主動(dòng)性死亡過程，也是正常的細(xì)胞生理應(yīng)答反應(yīng)，凋亡的細(xì)胞最終將被體內(nèi)吞噬細(xì)胞處理。過度的細(xì)胞凋亡將直接導(dǎo)致組織器官功能的下降；而對(duì)于癌細(xì)胞來(lái)說，凋亡過程中斷則意味著癌癥的發(fā)展和擴(kuò)散。
通常可分為3個(gè)階段。細(xì)胞凋亡初期是細(xì)胞的間接觸消失，但是胞膜尚完整，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體脫落，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮表現(xiàn)，本階段持續(xù)時(shí)間很短；細(xì)胞凋亡中期是細(xì)胞核碎裂后與細(xì)胞內(nèi)的各種細(xì)胞器結(jié)合，并進(jìn)一步被質(zhì)膜包裹形成凋亡小體；凋亡晚期是吞噬細(xì)胞吞噬凋亡小體，并將其消化為重新供機(jī)體使用。
圖1：細(xì)胞凋亡的不同階段
細(xì)胞凋亡的機(jī)制
（1）細(xì)胞凋亡的死亡受體途徑及調(diào)控：死亡因子受體(Fas)/死亡因子Fas配體( FasL)死亡通路 ；TNFR 死亡通路。
（2）線粒體途徑及調(diào)控。
（3）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路：CHOP通路；JNK 通路；Caspases 12通路。
（4）端粒酶途徑的細(xì)胞凋亡。
（5）NO參與的細(xì)胞凋亡反應(yīng)。
常用的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法有以下幾種：
①形態(tài)學(xué)檢測(cè)
發(fā)生凋亡的細(xì)胞在形態(tài)上有一定的特征，最常用的形態(tài)學(xué)檢測(cè)手段是熒光共聚焦激光掃描顯微鏡和透射電子顯微鏡，前者可讓特異性染料（Hoechst 33342、Hoechst 33258、DAPI）染色，可非嵌入式結(jié)合A-T堿基區(qū)的DNA在受到紫外線激發(fā)時(shí)會(huì)發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光。
圖2：DAPI染色，Hela細(xì)胞凋亡時(shí)核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)變化
同時(shí)，凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結(jié)構(gòu)；Ⅱa 期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。電鏡下可看到凋亡細(xì)胞體積變小，表面微絨毛消失，細(xì)胞質(zhì)濃縮。
圖3：電鏡下，Jurkat細(xì)胞凋亡時(shí)核染色質(zhì)的形態(tài)變化
②用的最多的Annexin V /PI雙染色法檢測(cè)早期凋亡
正常細(xì)胞膜的磷脂分布是不對(duì)稱的，活細(xì)胞中磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine, PS)位于細(xì)胞膜的內(nèi)表面，細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞膜發(fā)生變化， PS從細(xì)胞膜的內(nèi)表面翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的外表面。Annexin V是一種對(duì)PS有高度親和力的、鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，Annexin V可以特異性地識(shí)別凋亡細(xì)胞表面的PS, 而活細(xì)胞的PS位于細(xì)胞膜的內(nèi)表面，無(wú)法與Annexin V特異性結(jié)合。所以可以用FITC偶聯(lián)的Annexin V鑒別凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞。
壞死細(xì)胞的PS也會(huì)從細(xì)胞膜的內(nèi)表面翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的外表面，Annexin V也能識(shí)別壞死細(xì)胞表面的PS, 所以Annexin V無(wú)法區(qū)分壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。而PI染料能夠與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，區(qū)分壞死細(xì)胞和活細(xì)胞。早期凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞的細(xì)胞膜仍然完整，PI染料無(wú)法自由通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA結(jié)合，所以PI染料無(wú)法標(biāo)記凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞，而PI染料卻能夠通過壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，壞死細(xì)胞內(nèi)PI染料被488nm激光激發(fā)后會(huì)發(fā)射紅熒光，被相應(yīng)通道接收。所以Annexin V和PI同時(shí)使用，就可以區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。
圖4：Annexin V /PI雙染色法檢測(cè)的原理
③細(xì)胞凋亡---線粒體膜電位檢測(cè)
JC-1是親脂性陽(yáng)離子熒光染料可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強(qiáng)或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低。正常生理狀態(tài)下，線粒體負(fù)電性高，JC-1進(jìn)入線粒體以多聚體存在，紅色熒光強(qiáng)，細(xì)胞凋亡時(shí)，線粒體去極化產(chǎn)生，負(fù)電性降低，JC-1則以單體存在細(xì)胞質(zhì)，綠色熒光增強(qiáng)。
圖5：JC-1線粒體膜電位檢測(cè)的流式對(duì)比圖
④細(xì)胞凋亡—活化的Caspase-3檢測(cè)
Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3 為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3 正常以酶原（32 KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的 Caspase-3 由兩個(gè)大亞基（17 KD）和兩個(gè)小亞基（12 KD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞，Caspase-3 的活性明顯下降。
活化的Caspase-3由其前體裂解的一個(gè)17KD亞單位和一個(gè)12KD亞單位組成，形成異二聚體，可被Anti-Active Caspase-3抗體特異性識(shí)別。用熒光素標(biāo)記Anti-Active Caspase-3抗體即可檢測(cè)到活化的Caspase-3。
圖6：Caspase家族在凋亡過程中的作用
⑤Tunel檢測(cè)法
此外，圍繞DNA斷裂的檢測(cè)方法還有脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（Terminal-Deoxynucleotidyl Transferase Mediated Nick End Labeling,TUNEL），即Tunel檢測(cè)法。細(xì)胞凋亡時(shí)DNA雙鏈或單鏈斷裂會(huì)產(chǎn)生大量的粘性3’-OH末端。以此為線索，在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）協(xié)助下，將生物素/熒光素標(biāo)記的dUTP綁定在3’-OH末端，并通過酶聯(lián)顯色或熒光檢測(cè)來(lái)定量分析結(jié)果。
圖7：Tunel檢測(cè)法示意圖
總之，細(xì)胞凋亡就是凋亡通路中的各種分子促成的，不能因?yàn)?/span>檢測(cè)單一指標(biāo)就輕易斷定凋亡的發(fā)生。畢竟，細(xì)胞凋亡事件中，每個(gè)指證只維持一段時(shí)間，因而各位小伙伴們應(yīng)該廣撒網(wǎng)、多撈魚，最好能在不同時(shí)間段進(jìn)行多指標(biāo)的同時(shí)檢測(cè)，這才能確定凋亡的發(fā)生。最后為了不造成假陽(yáng)性和假陰性，陽(yáng)性和陰性對(duì)照也是必不可少的，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
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