Topo克隆系列專題
——簡單、快速、高效的克隆策略
Topo克隆技術(shù)是通過TOPO載體上偶聯(lián)的異構(gòu)酶(Topoisomerase)實(shí)現(xiàn)插入片段的快速克隆。不同于傳統(tǒng)的TA克隆，Topo克隆技術(shù)能夠在2-5 min內(nèi)快速完成插入片段和載體的連接反應(yīng)，操作簡單，連接效率極高，克隆陽性率接近100%。
背 景
傳統(tǒng)的TA克隆對于PCR產(chǎn)物的要求較高，而且連接反應(yīng)時(shí)間很長，同時(shí)陽性率低，而且自連率很高，無形中會(huì)成倍地增加科研者寶貴的時(shí)間。翌圣生物推出Hieff Clone® TOPO系列克隆載體，能夠快速而且高效地得到目的重組載體。Hieff Clone® Zero TOPO載體為零背景載體，載體骨架中含有自殺ccdB基因。此克隆方法無需藍(lán)白斑篩選，陽性率100%。
Hieff Clone® Zero TOPO Simple系列載體，使用者在引入后續(xù)酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切操作時(shí)，不會(huì)受到MCS位點(diǎn)的影響，從而增加酶切效率以及克隆成功率。
TOPO克隆原理
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克隆原理：Topo載體兩端通過磷酸鍵偶聯(lián)Topo酶，連接反應(yīng)時(shí)，受插入片段的5'端羥基的攻擊，磷酸鍵釋放能量。利用該能量，插入片段5'端羥基與載體片段3'端磷酸基團(tuán)連接在一起，Topo異構(gòu)酶從載體分子上脫落，完成連接反應(yīng)。 |
零背景載體：Hieff Clone® Zero Topo載體骨架中含有ccdB致死基因。當(dāng)載體發(fā)生自連時(shí)，ccdB基因完整，會(huì)表達(dá)ccdB毒素蛋白，導(dǎo)致細(xì)菌死亡；當(dāng)插入片段成功連接時(shí)，ccdB基因不完整，ccdB基因不能完整表達(dá)，細(xì)菌存活。 |
Zero TOPO克隆與TA克隆方法的比較
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類別 |
反應(yīng)時(shí)間 |
反應(yīng)溫度 |
體系組成 |
克隆陽性率 |
PCR產(chǎn)物 |
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Zero TOPO |
2-5 min |
室溫 |
載體+插入片段 |
★★★★★ |
Blunt載體無需加“A” |
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TA克隆 |
過夜 |
16℃ |
載體+插入片段+T4連接酶 |
★★ |
需要加“A” |
產(chǎn)品特點(diǎn)
快速：僅需2-5 min即可完成連接反應(yīng)
高效：無自連現(xiàn)象，陽性克隆率100%
簡便：只需加入目的片段即可
操作流程
產(chǎn)品實(shí)例
高效克隆1-5 kb基因
圖1：Hieff Clone® Zero TOPO-Blunt Cloning Kit可有效克隆1-5 kb基因，成功率100%。A-C：TOPO克隆轉(zhuǎn)化平板。D-F：插入片段PCR鑒定電泳圖。
同類產(chǎn)品比較
圖2：相同體系下，克隆3 kb目的基因，Hieff Clone®Zero TOPO-Blunt Cloning Kit較同類產(chǎn)品具有高連接效率。
部分發(fā)表文獻(xiàn)
[1]. Tang Y Y, Li Y T, Zha X H, et al. A complement factor I (CFI) gene mediates innate immune responses in yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco[J]. Genomics, 2020.
[2]. Zhu L, Xia C, Wu L, et al. The critical role of RasGRP4 in the growth of diffuse large B cell lymphoma[J]. Cell Communication and Signaling, 2019, 17(1): 92.
[3]. Liu Q, Zhang L, Shu Z, et al. Two paternal mosaicism of mutation in ELANE causing severe congenital neutropenia exhibit normal neutrophil morphology and ROS production[J]. Clinical Immunology, 2019, 203: 53-58.
[4]. Zhuang L, Ji Y, Tian P, et al. Polymerase chain reaction combined with fluorescent lateral flow immunoassay based on magnetic purification for rapid detection of canine parvovirus 2[J]. BMC veterinary research, 2019, 15(1): 30.
FAQ
» Q1：從質(zhì)粒上酶切的產(chǎn)物可直接連接Topo載體嗎？為什么？
A：Topo載體進(jìn)行連接反應(yīng)的時(shí)候需要5'羥基端和Topo酶發(fā)生反應(yīng)。PCR產(chǎn)物5'羥基端沒有磷酸化，可以直接進(jìn)行TOPO克隆。但是，酶切產(chǎn)物5'端為磷酸化狀態(tài)，可以直接進(jìn)行TA克隆的，但是不能進(jìn)行Topo克隆。如果需要，可以用牛小腸堿性磷酸酶（CIP）進(jìn)行去磷酸化處理后連接Topo載體。
» Q2：連接反應(yīng)體系和反應(yīng)時(shí)間以及溫度對連接效率的影響大嗎？
A：建議反應(yīng)體系應(yīng)控制在10 μL內(nèi)，體系太小連接會(huì)受到影響。如果目的基因濃度太低，建議濃縮之后再連接，以提高連接成功率。插入片段使用量參考說明書。一般1-2 min即可完成連接反應(yīng)，若想得到更多克隆，可適當(dāng)延長至 5min，但不能超過5 min。室溫反應(yīng)即可。
» Q3：如何選擇合適的載體？
A：若PCR產(chǎn)物為Taq酶擴(kuò)增則選擇TOPO-TA克隆載體系列，若PCR產(chǎn)物為高保真酶擴(kuò)增則選擇Blunt載體系列。Simple載體不含多克隆位點(diǎn)區(qū)，可根據(jù)客戶需求在PCR擴(kuò)增時(shí)添加自己需要的酶切位點(diǎn)。
» Q4：若是儲(chǔ)存了很久的PCR產(chǎn)物還能用來做克隆嗎？
A：建議采用新鮮的PCR產(chǎn)物會(huì)使連接效率更高一些，若是-20℃保存的一周內(nèi)還可以使用。請避免PCR產(chǎn)物的反復(fù)凍融和降解。
» Q5：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物需要純化嗎？
A：先對PCR產(chǎn)物跑膠鑒定，若是PCR產(chǎn)物電泳條帶單一、濃度較高且無引物二聚體可直接進(jìn)行連接反應(yīng)。若是有雜帶或引物二聚體建議純化之后再進(jìn)行連接反應(yīng)。
產(chǎn)品信息
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名稱 |
貨號 |
規(guī)格 |
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10909ES20 |
20 T |
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Hieff Clone® Zero TOPO-Blunt Simple Cloning Kit, MCS-Depleted |
10910ES20 |
20 T |
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10907ES20 |
20 T |
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10908ES20 |
20 T |
相關(guān)產(chǎn)品
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名稱 |
貨號 |
規(guī)格 |
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11802ES80 |
10×100 μL |
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11802ES92 |
100×100 μL |
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11801ES80 |
10×100 μL |
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11801ES92 |
100×100 μL |
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BL21 (DE3) Chemically Competent Cell BL21 (DE3)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞 |
11804ES80 |
10×100 μL |
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10911ES08 |
5 T |
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10911ES20 |
20 T |
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10912ES08 |
5 T |
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10912ES10 |
10 T |
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10148ES10 |
10 U |
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10148ES60 |
100 U |
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10148ES76 |
500 U |
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10148ES80 |
1000 U |
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10149ES01 |
100 μL |
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10149ES03 |
1 mL |
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10149ES08 |
5×1 mL |
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10106ES03 |
1 mL |
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10106ES08 |
5×1 mL |
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YeaRed Nucleic Acid Gel Stain (10,000× in Water) YeaRed 核酸染料（10,000× 水溶液） |
10202ES76 |
500 μL |
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10208ES60 |
100 g |
HB210723
