CMFDA，英文全稱5-chloromethylfluorescein diacetate，是一種可自由透過活細(xì)胞膜對細(xì)胞進(jìn)行示蹤的熒光染料。

CMFDA是二乙酸熒光素（Fluorescein diacetate，F(xiàn)DA）的氯甲基衍生物，具細(xì)胞膜滲透性，不具有熒光發(fā)光性。當(dāng)通過被動運(yùn)輸穿透細(xì)胞膜進(jìn)入活細(xì)胞后，CMFDA中的親脂性基團(tuán)可被胞漿內(nèi)非特異性酯酶水解，生成5-氯甲基熒光素（5-chloromethylfluorescein）；5-氯甲基熒光素可發(fā)出綠色熒光，  因帶電荷而不能自由穿透細(xì)胞膜，并利用自身氯甲基與細(xì)胞內(nèi)蛋白和多肽中的谷胱甘肽在谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶作用下生成加合物，能完好的保留在胞內(nèi)。經(jīng)CMFDA標(biāo)記的細(xì)胞，熒光非常穩(wěn)定，穩(wěn)定標(biāo)記的時間可達(dá)數(shù)天（至少3天），因此非常適用于細(xì)胞分化和形態(tài)發(fā)生等研究。與常用的鈣黃綠素和FDA相比，具有較長時間的細(xì)胞內(nèi)信號保留特點(diǎn)。

在細(xì)胞分裂增殖過程中，CMFDA標(biāo)記熒光可分配至兩個子代細(xì)胞中，且具有不會使鄰近細(xì)胞染色的功能（有極少情況下通過細(xì)胞間縫隙連接發(fā)生染色）。同時，CMFDA標(biāo)記熒光還主要用于分析細(xì)胞間融合、細(xì)胞粘附及多藥耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究。此外，CMFDA還可用于與其他細(xì)胞示蹤染料聯(lián)合選擇性標(biāo)記感染細(xì)胞內(nèi)的病原菌；與膜不通透性核熒光探針共同使用，可用于細(xì)胞活性研究。

本品具有細(xì)胞示蹤試劑理想的特性：穩(wěn)定、無毒（工作濃度范圍內(nèi)）、細(xì)胞內(nèi)熒光保留性好、強(qiáng)熒光（生理pH范圍內(nèi)）。CMFDA標(biāo)記細(xì)胞呈綠色熒光，Ex=492 nm，Em=517 nm，可與其他顏色熒光染料，如紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP）等共染。本品以粉末形式提供，需用DMSO制備儲存液后再使用。

 

產(chǎn)品性質(zhì)

中文名稱（Chinese Synonym）	5-氯甲基熒光素二醋酸酯
英文名稱（English Synonym）	5-chloromethylfluorescein diacetate
CAS號（CAS NO.）	136832-63-8
分子式（Molecular Weight）	C25H17ClO7
分子量（Molecular Fomular）	464.85
外觀（Appearance）	白色或類白色固體
Ex/ Em	492/517 nm
結(jié)構(gòu)式（Structure）

 

運(yùn)輸與保存方法

室溫運(yùn)輸。-20℃干燥避光保存，有效期一年。避免反復(fù)凍融。

 

注意事項(xiàng)

1. 不同的細(xì)胞其細(xì)胞內(nèi)酯酶活性不同，因此染色效果具有差異性。

2. 熒光染料均存在淬滅問題，染色過程需盡量避光。

3. 避免使用含有巰基的緩沖液。

4. 為了您的健康，實(shí)驗(yàn)操作時請穿實(shí)驗(yàn)服和帶一次性手套。

5. 本產(chǎn)品僅作科研用途！

 

操作方法

1. CMFDA儲存液（10 mM）的配制

將本品取出回溫至室溫。用10.8 µL DMSO溶解50 µg CMFDA，充分混勻即得到10 mM的儲存液。第一次使用時，建議母液現(xiàn)配現(xiàn)用。且溶解后的試劑盡可能在短時間內(nèi)使用，以保證實(shí)驗(yàn)效果。母液遇水極易分解，若單次不能用完，建議分裝保存，用封口膜封口，并嚴(yán)格做到≤-20℃密封干燥保存。【避免反復(fù)凍融】
【注】： ① 本品容易吸潮，從冰箱取出后，請確認(rèn)在干燥的環(huán)境放至室溫后再開封。由于試劑極其微量，開封前請將其短暫離心，以保                     證粉末落入管底。

② 所用DMSO必須保證高質(zhì)量，新鮮無水，否則將會導(dǎo)致醋酸酯水解，使熒光染料無法進(jìn)入細(xì)胞，影響實(shí)驗(yàn)效果。

③ 建議您在正式實(shí)驗(yàn)前先摸索一下細(xì)胞量、熒光探針的終濃度、培養(yǎng)時間等，找到最佳實(shí)驗(yàn)條件。

2. CMFDA工作液（0.5-5 µM）的配制

使用前用無血清培養(yǎng)基稀釋上述儲存液至工作液濃度（0.5-25 µM），并將探針工作液于37℃預(yù)熱。
【注】：針對不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康乃璧墓ぷ饕簼舛炔煌韪鶕?jù)具體情況進(jìn)行優(yōu)化。一般來講：對于長期染色（至少3天）或快速分裂細(xì)胞的染色，推薦工作液濃度5-25 µM。對于短期染色，如細(xì)胞活力分析等實(shí)驗(yàn)，推薦工作液濃度0.5-5 µM。為避免過度加載造成細(xì)胞毒性，維持正常的細(xì)胞生理活性，建議在取得有效結(jié)果的基礎(chǔ)上盡量使用最低探針濃度。

3. 染色方法

3.1 懸浮細(xì)胞染色

1）離心收集細(xì)胞，并吸除上清。用預(yù)熱的探針工作液輕柔地重懸細(xì)胞。

2）于細(xì)胞正常生長條件下孵育15-45 min。

3）離心并去除探針工作液。

4）換用新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)30 min。

5）清洗細(xì)胞，如需固定請參考如下步驟【4.固定和通透處理】。

3.2 貼壁細(xì)胞的染色

1）吸除培養(yǎng)液。

2）輕輕加入預(yù)熱的探針工作液。

3）于細(xì)胞正常生長條件下孵育15-45 min。

4）換用新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)30 min。

5）清洗細(xì)胞，如需固定，請參考后續(xù)步驟【4.固定和通透處理】。

4.（可選）固定和通透處理

4.1 固定前，細(xì)胞需用PBS充分清洗。

【注】：當(dāng)細(xì)胞包被在含有巰基或蓋玻片表面上時，該清洗步驟尤為重要。

4.2 用3.7%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞15 min。

4.3 固定后于PBS中漂洗細(xì)胞。

4.4 （可選）后續(xù)如進(jìn)行其他抗體染色，需對細(xì)胞進(jìn)行通透處理，可將上述處理的細(xì)胞于預(yù)冷的丙酮中孵育10 min。

5 鏡檢

將上述處理的細(xì)胞用PBS漂洗后，進(jìn)行檢測。該探針呈綠色熒光，其Ex=492 nm，Em=517 nm。

 

 

HB220418