產(chǎn)品描述

Hoechst 33342/PI 雙染試劑盒（Hoechst 33342/PI Double Stain Kit）采用Hoechst 33342和碘化丙啶（PI）雙染的方法以區(qū)分凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的試劑盒。其檢測原理是：細(xì)胞核熒光染料Hoechst 33342可以穿透細(xì)胞膜，嵌入雙鏈DNA后釋放藍(lán)色熒光。對于正常細(xì)胞，其可少許進(jìn)入細(xì)胞膜使其染上低藍(lán)色。而凋亡細(xì)胞由于細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，從而使得進(jìn)入凋亡細(xì)胞內(nèi)的Hoechst 33342明顯多于正常細(xì)胞，熒光強(qiáng)度比正常細(xì)胞要高。另外，細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)染色質(zhì)會(huì)固縮，從而使得染料能更有效和聚集的結(jié)合于DNA，并且凋亡細(xì)胞膜上的p-糖蛋白泵功能受損而不能有效的將Hoechst 33342排除到細(xì)胞外使其在細(xì)胞內(nèi)的積累增加，這些特征都使得凋亡細(xì)胞經(jīng)染色后熒光會(huì)比正常細(xì)胞明顯增強(qiáng)。但細(xì)胞核熒光染料PI不能穿透細(xì)胞膜完整的正常細(xì)胞或凋亡細(xì)胞，即活細(xì)胞對PI染料拒染。而對于壞死細(xì)胞，其細(xì)胞膜的完整性在早期即已喪失，可被PI染色。

經(jīng)上述兩種染料雙染后，使用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測時(shí)，正常細(xì)胞為弱紅色熒光＋弱藍(lán)色熒光，凋亡細(xì)胞為弱紅色熒光＋強(qiáng)藍(lán)色熒光，壞死細(xì)胞為強(qiáng)紅色熒光＋弱藍(lán)色熒光。

本試劑盒染色快速方便，可用一步法或者兩步法進(jìn)行染色。使用流式細(xì)胞儀檢測時(shí)，無需稀釋等配制過程，也無需再準(zhǔn)備其它任何溶液。本試劑盒足夠檢測100個(gè)樣品，每個(gè)樣品的細(xì)胞數(shù)量可達(dá)105-106個(gè)。

產(chǎn)品組分

組分編號	組分名稱	40744ES60（100T）	保存方法
40744-A	Hoechst 33342 染色液 Hoechst 33342   Stain Solution	500 μL	4℃或-20℃避光保存
40744-B	PI 染色液 PI Stain Solution	500 μL	4℃或-20℃避光保存
40744-C	細(xì)胞染色緩沖液 Cell Stain Buffer	100 mL	4℃或-20℃保存

運(yùn)輸與保存方法

冰袋運(yùn)輸。 4℃保存，有效期12個(gè)月。-20℃保存，有效期24個(gè)月，建議分裝避免反復(fù)凍融。

注意事項(xiàng)

1）Hoechst 33342、PI對人體有害，請注意適當(dāng)防護(hù)；

2）Hoechst 33342、PI需避光，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程盡量避光操作；

3）熒光染料均存在淬滅情況，建議染色后需盡快檢測；

4）Hoechst 33342 與細(xì)胞孵育時(shí)間不宜過長，一般控制在20 min以內(nèi)。太長容易引起該染料的發(fā)射光譜由藍(lán)光向紅光遷移，導(dǎo)致紅色熒光和藍(lán)色熒光比例改變。

5）如果用于組織樣品檢測，則必須把組織消化制備成單細(xì)胞懸浮液后才可以進(jìn)行檢測。

6）為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

7）本產(chǎn)品僅作科研用途！

操作步驟

1. 樣品準(zhǔn)備

貼壁細(xì)胞：小心吸除培養(yǎng)液至一個(gè)無菌離心管內(nèi)備用。胰酶消化細(xì)胞，加入上述培養(yǎng)液，吹打所有貼壁細(xì)胞，并輕輕吹散細(xì)胞，收集至離心管內(nèi)，4℃，1000 g 離心3-5 min，使細(xì)胞沉淀至管底。小心吸除上清，可留約50 µL培養(yǎng)液，以免吸到細(xì)胞。加入約1 mL預(yù)冷PBS（Yeasen，貨號：60145ES76）， 重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至1.5 mL無菌離心管。4℃，1000 g 離心3-5 min，使細(xì)胞沉淀至管底。小心吸除上清，可留約50 µLPBS，以免吸到細(xì)胞。輕彈離心管底適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團(tuán)。

懸浮細(xì)胞：4℃，1000 g 離心3-5 min，使細(xì)胞沉淀至管底。小心吸除上清，可留約50 µL培養(yǎng)液，盡量避免吸到細(xì)胞。加入約1mL預(yù)冷PBS， 重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至1.5 mL無菌離心管。4℃，1000 g 離心3-5 min，使細(xì)胞沉淀到管底。小心吸除上清，可留約50 µL PBS，以免吸到細(xì)胞。輕彈離心管底適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團(tuán)。

2. 重懸細(xì)胞：取上述收集好的105-106個(gè)細(xì)胞，加入0.8-1 mL細(xì)胞染色緩沖液重懸細(xì)胞。

3. 細(xì)胞染色：

3.1 一步法染色

1）加入5 µLHoechst 33342染色液。
2）加入5 µLPI染色液。
3）輕輕混勻，冰浴或4℃孵育20-30 min。
注：盡快進(jìn)行后續(xù)熒光檢測

3.2 兩步法染色：

1）加入5 µLHoechst 33342染色液，置于37℃孵育5-15 min；

2）置于冰水浴中冷卻后，4℃ 1000 g離心3-5 min，吸除上層染色液；

3）加入0.8-1 mL細(xì)胞染色緩沖液重懸細(xì)胞沉淀；

4）加入5 µLPI染色液，置于冰浴或4℃，孵育5-15 min。
注：盡快進(jìn)行后續(xù)熒光檢測

4.  檢測與分析

4.1  流式細(xì)胞儀檢測：Hoechst 33342用氪離子激光激發(fā)紫外光，與 DNA結(jié)合后其最大激發(fā)波長為352 nm，發(fā)射波長為400- 500 nm（最大激發(fā)波長461nm），產(chǎn)生藍(lán)色熒光；PI用氬離子激光激發(fā)熒光，與DNA結(jié)合后可用激發(fā)波長488 nm（最大激發(fā)波長535 nm），發(fā)射波長大于575 nm（最大激發(fā)波長617 nm），產(chǎn)生紅色熒光，分析藍(lán)色熒光對紅色熒光的散點(diǎn)圖或地形圖。

結(jié)果判斷：在藍(lán)色熒光對紅色熒光的散點(diǎn)圖上，可將細(xì)胞分為三個(gè)群：

正常細(xì)胞：弱藍(lán)色熒光＋弱紅色熒光【Hoechst 33342+/PI+】；

凋亡細(xì)胞：強(qiáng)藍(lán)色熒光＋弱紅色熒光【Hoechst 33342++/PI+】；；

壞死細(xì)胞：弱藍(lán)色熒光＋強(qiáng)紅色熒光【Hoechst 33342+/PI++】；。

4.2 熒光顯微鏡觀察：檢測前4℃ 1000 g離心3-5 min，沉淀細(xì)胞，用PBS洗滌一次，再涂片觀察紅色和藍(lán)色熒光。
注：對于貼壁細(xì)胞使用熒光顯微鏡檢測，可以不收集細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，之后用PBS洗滌細(xì)胞一次，棄PBS洗滌液。然后直接依次按照上述比例加入細(xì)胞染色緩沖液、 Hoechst 33342染色液和PI染色液冰浴或4℃染色20-30 min。染色后PBS洗滌一次，然后在熒光顯微鏡下觀察。Hoechst 33342用氪離子激光激發(fā)紫外光，與 DNA結(jié)合后其最大激發(fā)波長為352 nm，發(fā)射波長為400-500 nm（最大激發(fā)波長461 nm），產(chǎn)生藍(lán)色熒光；PI用氬離子激光激發(fā)熒光，與DNA結(jié)合后可用激發(fā)波長488 nm（最大激發(fā)波長535 nm），發(fā)射波長大于575 nm（最大激發(fā)波長617 nm），產(chǎn)生紅色熒光。

相關(guān)產(chǎn)品

60145ES76	1×PBS, pH 7.4, Cell Culture Grade	500 mL
40710ES03	Propidium iodide Stain Solution（1 mg/mL）	1 mL
40730ES03	Hoechst 33258 Stain Solution（1 mg/mL）	1 mL
40732ES03	Hoechst 33342 Stain Solution (1 mg/mL)	1 mL
40722ES03	7-AAD	1 mg
40747ES76	Calcein-AM/PI Double Stain Kit	500 T
40301ES50	Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit	50 T
40302ES20	Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit	20 T
40305ES20	Annexin V-Alexa Fluor 488/PI Apoptosis Detection Kit	20 T

HB220609