漢遜酵母宿主細(xì)胞DNA殘留檢測(cè)試劑盒是用于定量分析檢測(cè)各種生物制品的中間品、半成品和成品中漢遜酵母殘留DNA含量的試劑盒。

本試劑盒采用探針法熒光定量PCR原理，可專一快速的檢測(cè)漢遜酵母細(xì)胞的殘留DNA，其定量限可以達(dá)到3 fg/μL水平。該試劑盒可與本公司的磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用。

 

組分信息

組分編號(hào)	組分名稱	41317ES50	41317ES60
41317-A	Hansenula polymorpha qPCR Mix	0.75 mL	1.5 mL
41317-B	Hansenula polymorpha Primer&Probe Mix	200 μL	400 μL
41317-C	DNA Dilution Buffer	1.8 mL×2管	1.8 mL×4管
41317-D	Hansenula polymorpha DNA Control（30 ng/μL）	25 μL	50 μL
41317-E	IC*	50 μL	100 μL

^*IC：Internal control，內(nèi)部對(duì)照

 

儲(chǔ)存條件

1. 所有組分均干冰運(yùn)輸，-25~-15℃保存，有效期2年。其中，41317-A和41317-B均需避光保存。

2. 收到貨后，請(qǐng)檢查共5個(gè)組分是否齊全，并立即放入對(duì)應(yīng)的保存溫度中儲(chǔ)存。

 

注意事項(xiàng)

1. 本產(chǎn)品僅作科研用途。

2. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。

3. 使用本試劑前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說明書，實(shí)驗(yàn)應(yīng)規(guī)范操作，包括樣本處理、反應(yīng)體系的配制及加樣。

4. 每個(gè)組分在使用前都應(yīng)充分震蕩混勻，低速離心。

 

適用機(jī)型

包含但不限于以下儀器：

Thermo Scientific：ABI 7500，ABI Quant Studio 5，ABI Step OnePlus；

Bio-Rad：CFX96 Optic Module；

上海宏石醫(yī)療科技：SLAN-96S。

 

使用說明

1. Hansenula polymorpha DNA Control定量參考品的稀釋和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

用試劑盒中提供的DNA Dilution Buffer（DNA稀釋液）將Hansenula polymorpha DNA Control定量參考品梯度稀釋^*，稀釋濃度依次為3 ng/μL、300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL。

具體操作如下：

1）將試劑盒中的Hansenula polymorpha DNA Control定量參考品和DNA Dilution Buffer置于冰上融化，待完全融化后，輕微振蕩混勻，低速離心10 sec。

2）取6支潔凈的1.5 mL離心管，分別標(biāo)記為Std0、Std1、Std2、Std3、Std4、Std5。

3）在標(biāo)記為Std0的1.5 mL離心管中加90 μL DNA Dilution Buffer和10 μL Hansenula polymorpha DNA Control定量參考品，Std0即稀釋為3 ng/μL濃度，振蕩混勻后低速離心10 sec，該濃度可分裝置于-25~-15℃短期保存（不超過3個(gè)月）^**，使用時(shí)避免反復(fù)凍融。

4）在Std1、Std2、Std3、Std4、Std5離心管中先分別加入90 μL DNA Dilution Buffer^***，再進(jìn)行梯度稀釋^****，具體稀釋方法如下：

稀釋管	稀釋比例	終濃度
Std1	10 μL Std0 + 90 μL DNA Dilution Buffer	300 pg/μL
Std2	10 μL Std1 + 90 μL DNA Dilution Buffer	30 pg/μL
Std3	10 μL Std2 + 90 μL DNA Dilution Buffer	3 pg/μL
Std4	10 μL Std3 + 90 μL DNA Dilution Buffer	300 fg/μL
Std5	10 μL Std4 + 90 μL DNA Dilution Buffer	30 fg/μL

表1 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋

^*每個(gè)濃度做3個(gè)復(fù)孔，該試劑可測(cè)試300 pg/μL~30 fg/μL線性范圍。若需要，可適當(dāng)擴(kuò)大或縮小線性范圍。

^**為減少反復(fù)凍融次數(shù)和避免污染，建議初次使用時(shí)將DNA定量參考品分裝儲(chǔ)存于-25~-15℃。

^***已融化未使用的DNA稀釋液可保存于2-8℃ 7天，若長(zhǎng)時(shí)間不用，請(qǐng)放置于-25~-15℃。

^****為確保模板完全混勻，每個(gè)梯度稀釋時(shí)需輕微震蕩混勻約1 min。

2. 樣本加標(biāo)回收質(zhì)控ERC的制備

根據(jù)需要設(shè)置ERC中Hansenula polymorpha DNA標(biāo)準(zhǔn)品濃度（以制備加30 pg Hansenula polymorpha DNA量的ERC為例），具體操作如下：

1）取100 μL待測(cè)樣本加入1.5 mL潔凈的離心管中，再加入10 μL Std3，混勻，標(biāo)記為ERC。

2）加標(biāo)回收ERC和同批待測(cè)樣本一起進(jìn)行樣本前處理，制備加標(biāo)回收ERC純化液。

3. 陰性抽提質(zhì)控NCS的制備

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性抽提質(zhì)控NCS，具體操作如下：

1）取100 μL樣本基質(zhì)溶液（或DNA稀釋液）加入1.5 mL潔凈的離心管中，標(biāo)記為NCS。

2）陰性質(zhì)控NCS和同批待測(cè)樣本一起進(jìn)行樣本前處理，制備成陰性質(zhì)控NCS純化液。

4. 無模板對(duì)照NTC的制備

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置無模板對(duì)照NTC，具體操作如下：

1）無模板對(duì)照NTC無需進(jìn)行樣本前處理，在qPCR法檢測(cè)殘留DNA含量階段開始配置即可。

2）每管或孔中NTC樣本為20 μL Mix混合液（即15 μL Hansenula polymorpha qPCR Mix + 4μL Hansenula polymorpha Primer&Probe Mix + 1 μL IC）+ 10 μL DNA Dilution Buffer，建議配置3個(gè)重復(fù)孔的量。

5. 反應(yīng)體系

組分	體積(μL)
Hansenula polymorpha qPCR Mix*	15
Hansenula polymorpha Primer&Probe Mix	4
IC	1
DNA Template**	10
總體積***	30

表2 標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系

^*根據(jù)反應(yīng)孔數(shù)計(jì)算本次所需Mix混合液總量：Mix混合液=（反應(yīng)孔數(shù)+2）× (15+4+1) μL（含有2孔的損失量）。通常，每個(gè)樣本做3個(gè)重復(fù)孔。

^**反應(yīng)孔數(shù)=（5個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線+1個(gè)無模板對(duì)照NTC+1個(gè)陰性抽提質(zhì)控NCS+待測(cè)樣本TS個(gè)數(shù)+待測(cè)樣本對(duì)應(yīng)加標(biāo)回收ERC個(gè)數(shù)）× 3。

NTC (No Template Control)：DNA Dilution Buffer

NCS (Negative Control Solution)：樣本基質(zhì)溶液或DNA Dilution Buffer進(jìn)行樣本前處理后，所得純化液為NCS

TS (Test Sample)：待測(cè)樣本

ERC (Extraction Recovery Control)：待測(cè)樣本中加入如10 μL的3 pg/μL標(biāo)準(zhǔn)品DNA后進(jìn)行樣本前處理，所得純化液為加標(biāo)回收ERC

^***加樣完成密封好管子后，請(qǐng)低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底，再震蕩混勻5 sec以上，完全混勻反應(yīng)液，再低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底，如有氣泡，需將氣泡排盡。

下表為參考板位：

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

NTC

待測(cè)樣本TS1

待測(cè)樣本TS1

待測(cè)樣本TS1

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std1

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std1

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std1

B

NTC

待測(cè)樣本TS2

待測(cè)樣本TS2

待測(cè)樣本TS2

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std2

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std2

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std2

C

NTC

待測(cè)樣本TS3

待測(cè)樣本TS3

待測(cè)樣本TS3

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std3

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std3

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std3

D

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std4

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std4

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std4

E

NCS

樣本加標(biāo)ERC1

樣本加標(biāo)ERC1

樣本加標(biāo)ERC1

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std5

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std5

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std5

F

NCS

樣本加標(biāo)ERC2

樣本加標(biāo)ERC2

樣本加標(biāo)ERC2

G

NCS

樣本加標(biāo)ERC3

樣本加標(biāo)ERC3

樣本加標(biāo)ERC3

H

表3 上機(jī)參考板位

該示例是對(duì)漢遜酵母殘留DNA qPCR法檢測(cè)操作的展示，檢測(cè)樣本包括：5個(gè)濃度梯度的漢遜酵母DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線、1個(gè)無模板對(duì)照NTC、1個(gè)陰性質(zhì)控NCS、3個(gè)待測(cè)樣本TS、3個(gè)加樣回收ERC。建議每個(gè)樣本做3個(gè)重復(fù)孔。

6. 擴(kuò)增程序參數(shù)設(shè)置（兩步法）（以ABI公司7500 qPCR儀、軟件版本2.0為例）

1）創(chuàng)建空白新程序，選擇絕對(duì)定量檢測(cè)模板。

2）創(chuàng)建2個(gè)檢測(cè)探針，Target 1命名為“漢遜酵母-DNA”，選擇報(bào)告熒光基團(tuán)為“FAM”，猝滅熒光基團(tuán)為“none”；Target 2命名為“IC”，選擇報(bào)告熒光基團(tuán)為“CY5”，猝滅熒光基團(tuán)為“none”。參比熒光為“ROX”（參比熒光可根據(jù)儀器型號(hào)等情況，選擇是否需要添加）。

3）在“Assign target (s) to the selected wells”面板中，將標(biāo)準(zhǔn)曲線孔的“Task”一欄設(shè)置為“Standard”，并且在“Quantity”一欄分別賦值為“300000”、“30000”、“3000”、“300”、“30”（含義為每孔DNA濃度，單位為fg/μL），并且在相應(yīng)的“Sample Name”一欄命名為“300 pg/μL”、“30 pg/μL”、“3 pg/μL”、“300 fg/μL”、“30 fg/μL”；將無模板對(duì)照NTC孔的“Task”一欄設(shè)置為“NTC”；將陰性質(zhì)控NCS孔、待測(cè)樣本TS孔、樣本加標(biāo)回收ERC孔的“Task”一欄設(shè)置為“Unknown”，并且在相應(yīng)的“Sample Name”一欄中分別命名為“NCS”、“TS”、“ERC”，參比熒光勾選“ROX”，之后點(diǎn)擊“Start Run”，開始儀器運(yùn)行。

4）擴(kuò)增程序設(shè)置：設(shè)置三步法擴(kuò)增程序，反應(yīng)體積30 μL。

循環(huán)步驟	溫度（℃）	時(shí)間	循環(huán)數(shù)
預(yù)變性	95℃	5 min	1
變性	95℃	15 sec	45
退火/延伸（收集熒光）	60℃	30 sec

表4 擴(kuò)增程序

7. qPCR結(jié)果分析

1）在“Analysis”的“Amplification Plot”面板中，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)給出“Threshold”，有時(shí)系統(tǒng)給出的“Threshold”離基線太近，導(dǎo)致復(fù)孔之間Ct相差甚遠(yuǎn)，可手動(dòng)調(diào)節(jié)“Threshold”至合適位置，點(diǎn)擊“Analyze”。此時(shí)可在“Multicomponent Plot”初步查看擴(kuò)增曲線的形態(tài)是否正常。

2）在“Analysis”的“Standard Curve”面板中，可讀取標(biāo)準(zhǔn)曲線的R²、擴(kuò)增效率（Eff%）、斜率（Slope）、截距（Intercept）等。正常的標(biāo)曲：R²＞0.99，擴(kuò)增效率在90%≤Eff%≤110%范圍內(nèi)，Slope在-3.6~-3.1。

3）在“Analysis”的“View well table”面板中，“Quantity”一欄可讀取無模板對(duì)照NTC、陰性質(zhì)控NCS、待測(cè)樣本TS、樣本加標(biāo)回收ERC的檢測(cè)值，單位為fg/μL，后續(xù)可在檢測(cè)報(bào)告中將單位換算成pg/μL或pg/mL。

4）結(jié)果分析的參數(shù)設(shè)置需依據(jù)具體的機(jī)型及使用的軟件版本，一般也可由儀器自動(dòng)判讀。

5）根據(jù)待測(cè)樣本TS和樣本加標(biāo)回收ERC的檢測(cè)結(jié)果計(jì)算加標(biāo)回收率，加標(biāo)回收率要求在50%～150%之間。加標(biāo)回收率計(jì)算公式：回收率(%) = {樣本加標(biāo)測(cè)定值(eg.pg/µL)-樣本測(cè)定值(eg.pg/µL)}×洗脫體積(eg.µL) / DNA加入量理論值(eg.pg)×100%。

6）陰性質(zhì)控NCS的Ct值應(yīng)大于標(biāo)曲最低濃度Ct的均值。

7）無模板對(duì)照NTC的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為Undetermined或Ct值≥35。

8）待測(cè)樣本的Ct-IC值應(yīng)該與NTC的Ct-IC值一致或±1，如果待測(cè)樣本的Ct-IC值與NTC的Ct-IC值相比明顯增大，則表明樣本可能存在明顯抑制。如果同時(shí)測(cè)試加標(biāo)樣本，則優(yōu)先考慮樣本加標(biāo)回收率結(jié)果，IC結(jié)果作為參考。

 

Ver.CN20230605