DNase活性檢測(cè)試劑盒（熒光標(biāo)記法）使用一種新型DNA底物，其一端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)分子，另一端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)。在不存在DNase時(shí)，淬滅基團(tuán)的物理接近會(huì)將熒光報(bào)告基團(tuán)中的熒光淬滅到極低水平。當(dāng)有DNase時(shí)，DNA底物被水解，熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)在溶液中的空間上發(fā)生分離，這導(dǎo)致熒光報(bào)告基團(tuán)在被適當(dāng)波長的光激發(fā)時(shí)發(fā)出明亮的熒光，該熒光可以通過多功能酶標(biāo)儀（含熒光模塊）和熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。

DNase活性檢測(cè)試劑盒（熒光標(biāo)記法）采用底物熒光標(biāo)記法，可定量或定性的檢測(cè)單個(gè)樣品中的DNase，從而判斷樣本是否有DNase污染。

 

產(chǎn)品信息

貨號(hào)	41322ES48 / 41322ES68
規(guī)格	48 T / 192 T
檢測(cè)范圍	1.25×10-6U/μL~1×10-5U/μL
檢測(cè)方法	熒光標(biāo)記法
檢測(cè)時(shí)長	1小時(shí)
靈敏度	1.25×10-6U/μL
板內(nèi)差	<10%
板間差	<15%

 

儲(chǔ)存條件

Part Ⅰ，-25~-15℃保存；Part Ⅱ，常溫保存*。有效期1年**；

*Part Ⅰ，-25~-15℃運(yùn)輸；Part Ⅱ，常溫運(yùn)輸。收到貨后，請(qǐng)檢查各組分是否齊全，并立即放入對(duì)應(yīng)的保存溫度中儲(chǔ)存。

**試劑盒未拆封有效期1年，拆封后有效期6個(gè)月，建議將A組分溶液按照每次使用量進(jìn)行分裝避免反復(fù)凍融影響質(zhì)量。

 

使用說明

1. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1. 本試劑盒未提供但實(shí)驗(yàn)所需的實(shí)驗(yàn)材料：

a. 無 DNase 無 RNase 移液器與吸頭

b. 無 DNase 無 RNase EP 管

c. 無 DNase 無 RNase 黑色不透明底 96 孔板

2. 本試劑盒未提供但實(shí)驗(yàn)所需的實(shí)驗(yàn)設(shè)備和儀器：

a. 多功能酶標(biāo)儀（含熒光模塊，含ex/em=485/525nm波長，且具有熒光增益值調(diào)節(jié)功能)或者熒光定量PCR儀。

3. 實(shí)驗(yàn)環(huán)境準(zhǔn)備

為避免外源DNase污染，實(shí)驗(yàn)開始前，先使用試劑盒中的Surface DNase Remover（41322-G）對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境進(jìn)行處理，可噴灑于實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、手套等表面，5分鐘后用潔凈紙巾擦拭干凈即可進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作。

4. 試劑配制

所有試劑在實(shí)驗(yàn)前，請(qǐng)先平衡至室溫（18~25℃），充分振蕩混勻后，瞬時(shí)離心（4000~7000rpm離心10秒）。

1. DNase Substrate Stock solution：將A組分平衡至室溫后，4000~7000rpm離心60s，小心打開蓋子后加入40μL B組分制備成DNase Substrate Stock solution，然后根據(jù)每次實(shí)驗(yàn)用量將母液進(jìn)行分裝，-25~-15℃儲(chǔ)存，避免反復(fù)凍融。
2. DNase Substrate Work solution：實(shí)驗(yàn)開始前，取出DNase Substrate Stock solution恢復(fù)至室溫后進(jìn)行50倍稀釋，現(xiàn)配現(xiàn)用，注意避光。舉例：向10μL DNase Substrate Stock solution中加入490μL B組分，輕微震蕩混勻后離心。

5. 首次使用時(shí)的增益值調(diào)節(jié)

因?qū)嶒?yàn)室所用酶標(biāo)儀不同，首次測(cè)試前需調(diào)節(jié)合適的增益值，以避免靈敏度下降或信號(hào)過飽和的風(fēng)險(xiǎn)。

1. 加樣：

實(shí)驗(yàn)前注意事項(xiàng)：1. 加樣操作應(yīng)盡量快，時(shí)間過長會(huì)影響實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性；2. 所有試劑使用前應(yīng)充分混勻，加樣時(shí)應(yīng)將樣品加入酶標(biāo)板孔中底部，避免加在孔壁上部，加樣時(shí)注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。

使用無DNase無RNase黑色不透明底96孔板，選擇2個(gè)孔，每孔加入10μL DNase Substrate Work solution和10μL C組分；隨后向2個(gè)孔中的其中1個(gè)孔內(nèi)加入80μL F組分（陰性對(duì)照，NC），另外1個(gè)孔內(nèi)加入79μL F組分+1μL D組分（陽性對(duì)照1，PC1）。

組分編號(hào)	組分名稱	體積（總體積100 μL）
		NC	PC1
/	DNase Substrate Work solution	10 μL	10 μL
C	10×Reaction buffer	10 μL	10 μL
F	DNase&RNase free water	80 μL	79 μL
D	DNase I（2U/μL）	/	1 μL

表1：增益值調(diào)節(jié)體系配制

2. 孵育：

在37℃條件下避光放置30min后測(cè)試。

3. 儀器參數(shù)設(shè)置：

溫度37℃，終點(diǎn)模式，檢測(cè)前振板10~15s，激發(fā)波長λEx = 485 nm，發(fā)射波長λEm = 525 nm。

4. 增益值調(diào)節(jié)：

如果酶標(biāo)儀有自動(dòng)增益選項(xiàng)，則選用自動(dòng)增益。如果酶標(biāo)儀沒有自動(dòng)增益選項(xiàng)，則根據(jù)增益值范圍先設(shè)置中間值，然后根據(jù)反應(yīng)后陽性對(duì)照1（PC1）的熒光值來調(diào)節(jié)合適的增益值：如超過儀器上限，則適當(dāng)降低增益值，如遠(yuǎn)低于儀器上限，則適當(dāng)調(diào)高增益值。

*不同熒光酶標(biāo)儀的參數(shù)不一樣，首次測(cè)試前需調(diào)節(jié)合適的增益值，若酶標(biāo)儀不具備設(shè)置增益值的功能，可選用熒光定量PCR儀(含F(xiàn)AM通道)配套無DNase無RNase的qPCR八聯(lián)管或qPCR 96孔板使用。熒光定量PCR儀參數(shù)設(shè)置為FAM通道，反應(yīng)程序37℃，1min (讀取熒光)，30個(gè)循環(huán)，反應(yīng)體積100μL。使用原始熒光曲線數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，第1個(gè)循環(huán)作為RFU₀，第30個(gè)循環(huán)作為RFU₃₀。

2. 實(shí)驗(yàn)方法

本品可對(duì)樣品中具有活性的DNase進(jìn)行定性檢測(cè)或者定量檢測(cè)，用戶可根據(jù)實(shí)際情況和實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇使用其中一種檢測(cè)方法。本說明書中列舉了2種檢測(cè)方法的具體操作內(nèi)容。

實(shí)驗(yàn)前注意事項(xiàng)：1. 加樣操作應(yīng)盡量快，時(shí)間過長會(huì)影響實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性；2. 所有試劑使用前應(yīng)充分搖勻，加樣時(shí)應(yīng)將所加樣物加入酶標(biāo)板孔中底部，避免加在孔壁上部，加樣時(shí)注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。

1. 定性檢測(cè)：

1. 樣品和反應(yīng)體系制備：實(shí)驗(yàn)共設(shè)置3種樣品進(jìn)行檢測(cè)，包括1個(gè)陰性對(duì)照（NC），1個(gè)陽性對(duì)照2（PC2）和待測(cè)樣品（UnK）。先根據(jù)總樣品數(shù)量計(jì)算需要制備的反應(yīng)溶液體積（20μL/孔）：

組分編號(hào)	組分名稱	反應(yīng)溶液體積
		1個(gè)孔	10個(gè)孔	N個(gè)孔
/	DNase Substrate Work solution	10 μL	110 μL	10×（N+1）μL
C	10×Reaction buffer	10 μL	110 μL	10×（N+1）μL

表2：反應(yīng)溶液體系配制（定性實(shí)驗(yàn)）

再根據(jù)樣品數(shù)量把制備好的反應(yīng)溶液分裝到各孔中，20μL/孔。隨后向各孔中加入對(duì)應(yīng)樣品：

組分編號(hào)	樣品名稱	體積
		NC	PC2	UnK
F	DNase&RNase free water	80 μL	/	/
/	DNase I（2×10-5U/μL）*	/	80 μL	/
/	待測(cè)樣品（UnK）**	/	/	80 μL

表3：樣品添加（定性實(shí)驗(yàn)）

*DNase I（2×10^-5U/μL）：用Dilution Buffer 2（E組分）將DNase I（2U/μL）稀釋10⁵倍，每步稀釋倍數(shù)不要大于100倍，從而得到2×10^-5U/μL DNase I：

管號(hào)	Dilution Buffer 2的體積（μL）	加入的標(biāo)準(zhǔn)品體積（μL）	終濃度（U/μL）
A	198μL	2μL DNase I（2U/μL）	2×10-2 U/μL
B	198μL	2μL A	2×10-4 U/μL
C	180μL	20μL B	2×10-5 U/μL

表4：DNase I（2×10^-5U/μL）配制

**待測(cè)樣品（UnK）：需要根據(jù)實(shí)際待測(cè)樣本的情況，考慮是否需要用DNase&RNase free water對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋。建議進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，以評(píng)估是否存在因樣本抑制導(dǎo)致的假陰性情況。具體加標(biāo)樣品中終DNase I濃度建議為2×10^-5U/μL。選擇合適稀釋倍數(shù)時(shí)需要注意，如果UnK嚴(yán)重污染了DNase或含有干擾物質(zhì)時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)RFU₀（UnK）＞RFU₀（PC2），且RFU₃₀（UnK）＜2×RFU₀（UnK），導(dǎo)致假陰性結(jié)果的情況，說明當(dāng)前稀釋倍數(shù)不適合進(jìn)行樣本檢測(cè)，需要做進(jìn)一步稀釋或處理。

2. 檢測(cè)：

提前10min，預(yù)熱酶標(biāo)儀。立即讀取0min時(shí)的熒光信號(hào)值RFU₀。37℃避光放置30min后，再次讀取30min時(shí)的熒光信號(hào)值RFU₃₀，若采用動(dòng)力學(xué)模式，則可讀取0~30min所有熒光信號(hào)。

3. 結(jié)果判讀：

若NC的熒光值孵育前后變化不超過50%，PC2的RFU₃₀ 遠(yuǎn)大于 2RFU₀，且UnK的RFU₃₀≥2RFU₀，則判定UnK被DNase 污染。

2. 定量檢測(cè)：

1. 樣品制備：

DNase I標(biāo)準(zhǔn)品制備：

稀釋分2步進(jìn)行：先使用Dilution buffer 2將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成10×母液，再使用DNase&RNase free water將10×母液稀釋成終濃度。具體稀釋建議見下表。

稀釋1：

管號(hào)	Dilution Buffer 2的體積（μL）	加入的標(biāo)準(zhǔn)品體積（μL）	終濃度（U/μL）
a	198μL	2μL DNase I（2U/μL）	2×10-2 U/μL
b	198μL	2μL a	2×10-4 U/μL
c	100μL	100μL b	1×10-4 U/μL
d	100μL	100μL c	5×10-5 U/μL
e	100μL	100μL d	2.5×10-5 U/μL
f	100μL	100μL e	1.25×10-5 U/μL

表5：DNase I標(biāo)準(zhǔn)品稀釋1

稀釋2：

管號(hào)	DNase&RNase free water的體積（μL）	加入的標(biāo)準(zhǔn)品體積（μL）	終濃度（U/μL）
STD-A	180μL	20μL c	1×10-5 U/μL
STD-B	180μL	20μL d	5×10-6 U/μL
STD-C	180μL	20μL e	2.5×10-6 U/μL
STD-D	180μL	20μL f	1.25×10-6 U/μL
STD-E	200μL	0	0 U/μL

表6：DNase I標(biāo)準(zhǔn)品稀釋2

2. 反應(yīng)體系制備：實(shí)驗(yàn)共設(shè)置3種樣本進(jìn)行檢測(cè)，包括1個(gè)陰性對(duì)照（NC），DNase I標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品（UnK）。先根據(jù)總樣本數(shù)量計(jì)算需要制備的反應(yīng)溶液體積（20μL/孔）：

組分編號(hào)	組分名稱	反應(yīng)溶液體積
		1個(gè)孔	10個(gè)孔	N個(gè)孔
/	DNase Substrate Work solution	10 μL	110 μL	10×（N+1）μL
C	10×Reaction buffer	10 μL	110 μL	10×（N+1）μL

表7：反應(yīng)溶液體系配制（定量實(shí)驗(yàn)）

再根據(jù)樣本數(shù)量把制備好的反應(yīng)溶液分裝到各孔中，20μL/孔。隨后向各孔中加入對(duì)應(yīng)樣品：

組分編號(hào)	樣品名稱	體積
		NC	DNase I標(biāo)準(zhǔn)品	UnK
F	DNase&RNase free water	80 μL	/	/
/	表6中制備的STD A~G	/	80 μL	/
/	待測(cè)樣品（UnK）**	/	/	80 μL

表8：樣品添加（定量實(shí)驗(yàn)）

**待測(cè)樣品（UnK）：需要根據(jù)實(shí)際待測(cè)樣本的情況，考慮是否需要用DNase&RNase free water對(duì)樣本進(jìn)行適當(dāng)稀釋。建議進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，以評(píng)估是否存在因樣本抑制導(dǎo)致的假陰性情況。具體加標(biāo)樣品中終DNase I濃度建議為5×10^-6 U/μL。選擇合適稀釋倍數(shù)時(shí)需要注意，如果UnK嚴(yán)重污染了DNase或含有干擾物質(zhì)時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)RFU₀（UnK）＞RFU₀（PC2），且RFU₃₀（UnK）＜2×RFU₀（UnK），導(dǎo)致假陰性結(jié)果的情況，說明當(dāng)前稀釋倍數(shù)不適合進(jìn)行樣本檢測(cè)，需要做進(jìn)一步稀釋或處理。

推薦的板布局：

板布局	1	2	3	4	5	6~12
A	STD-A	STD-A		UnK-1	UnK-1
B	STD-B	STD-B		UnK-2	UnK-2
C	STD-C	STD-C		UnK-3	UnK-3
D	STD-D	STD-D		UnK-4	UnK-4
E	STD-E	STD-E		UnK-5	UnK-5
F				UnK-6	UnK-6
G				UnK-7	UnK-7
H	NC	NC		UnK-8	UnK-8

表9：推薦的板布局

3. 檢測(cè)：

提前10min，預(yù)熱酶標(biāo)儀。立即讀取0min時(shí)的熒光信號(hào)值RFU₀。37℃避光放置30min后，再次讀取30min時(shí)的熒光信號(hào)值RFU₃₀，若采用動(dòng)力學(xué)模式，則可讀取0~30min所有熒光信號(hào)。

4. 結(jié)果判讀：

計(jì)算?RFU=RFU₃₀-RFU₀，以?RFU(STD A~G)為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品DNase I濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，求出擬合方程y=ax+b，相關(guān)系數(shù)r≥0.99，將?RFU(UnK)作為y帶入方程，求出x，乘以樣本稀釋倍數(shù)后，即為樣本中DNase的濃度值。

*因儀器信號(hào)波動(dòng)，可能會(huì)出現(xiàn)?RFU＜0的情況，此時(shí)按?RFU=0計(jì)算。

 

產(chǎn)品性能

本試劑盒性能經(jīng)過充分評(píng)估，具體可聯(lián)系翌圣技術(shù)人員獲取相應(yīng)的性能驗(yàn)證報(bào)告。

 

注意事項(xiàng)

1）使用本試劑盒前請(qǐng)仔細(xì)閱讀本說明書；

2）請(qǐng)?jiān)谟行趦?nèi)使用該產(chǎn)品，禁止不同批次的相關(guān)試劑進(jìn)行混用；

3）所有試劑在使用之前，均需要恢復(fù)至室溫；

4）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作；

5）本產(chǎn)品僅用作科研用途。