細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化、原理及常用的檢測(cè)方法
細(xì)胞凋亡(Apoptosis)一詞首次出現(xiàn)在Kerr、Wyllie和Currie于1972年發(fā)表的一篇經(jīng)典論文中，用來(lái)描述一種形態(tài)學(xué)上獨(dú)特的細(xì)胞死亡形式。我們對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡過(guò)程相關(guān)機(jī)制的了解來(lái)自于對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中程序性細(xì)胞死亡的研究。細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是一種獨(dú)特而重要的“程序性”細(xì)胞死亡模式，它是由細(xì)胞的基因決定的。細(xì)胞凋亡通常發(fā)生在發(fā)育和衰老過(guò)程中，是維持組織內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的一種穩(wěn)態(tài)機(jī)制。如在免疫反應(yīng)中或當(dāng)細(xì)胞被疾病或有害物質(zhì)破壞時(shí)，細(xì)胞凋亡也作為一種防御機(jī)制發(fā)生。
在細(xì)胞凋亡的早期過(guò)程中，在光鏡下可以看到細(xì)胞收縮和固縮。細(xì)胞收縮時(shí)，細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)致密，細(xì)胞器排列更緊密。固縮是染色質(zhì)凝集的結(jié)果，是細(xì)胞凋亡最顯著的特征。在蘇木精和伊紅染色組織學(xué)檢查中，細(xì)胞凋亡為單細(xì)胞或小簇細(xì)胞。凋亡細(xì)胞呈圓形或橢圓形腫塊，胞質(zhì)呈深色嗜酸性，核染色質(zhì)呈致密紫色（圖1）。
圖1所示。圖1A是B6C3F1小鼠外分泌胰腺切片的顯微照片。箭頭表示細(xì)胞萎縮，胞漿濃縮的凋亡細(xì)胞，核固縮且碎裂。圖1B為14周齡大鼠心肌圖像，間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)凋亡細(xì)胞，胞漿濃縮，染色質(zhì)濃縮深染，細(xì)胞核碎片化(長(zhǎng)箭頭)。圖1C是對(duì)照大鼠胸腺組織的顯微照片。圖1D用地塞米松誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡的大鼠胸腺中的凋亡細(xì)胞圖片。在生理?xiàng)l件下，細(xì)胞凋亡通常影響單細(xì)胞或小簇細(xì)胞。凋亡的淋巴細(xì)胞小而深嗜堿性，細(xì)胞核固縮且常碎裂。巨噬細(xì)胞存在，胞漿被吞噬凋亡小巨噬細(xì)胞可見(jiàn)吞噬的細(xì)胞質(zhì)凋亡小體(箭頭)。 電鏡可以更好地確定亞細(xì)胞變化。在染色質(zhì)凝縮期早期，核破裂和細(xì)胞碎片分離到凋亡小體，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為“芽出”（圖2A, 2B）。凋亡小體由細(xì)胞質(zhì)組成，細(xì)胞器緊密排列，有或沒(méi)有核片段（圖2C）。細(xì)胞器仍然保持完整，所有這些都被包裹在一個(gè)完整的質(zhì)膜內(nèi)。這些小體隨后被巨噬細(xì)胞、實(shí)質(zhì)細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞吞噬，并在吞噬小體內(nèi)降解（圖2D）。吞噬和消化凋亡細(xì)胞的巨噬細(xì)胞被稱(chēng)為“可染體巨噬細(xì)胞”，經(jīng)常在淋巴濾泡的反應(yīng)性生發(fā)中心或胸腺皮層中發(fā)現(xiàn)?；旧蠜](méi)有與凋亡過(guò)程或凋亡細(xì)胞清除相關(guān)的炎癥反應(yīng)，原因有以下幾點(diǎn):
①凋亡細(xì)胞不將其細(xì)胞成分釋放到周?chē)拈g質(zhì)組織中;
②它們被周?chē)?xì)胞迅速吞噬，從而可能防止繼發(fā)性壞死;
③吞噬細(xì)胞不產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子。
圖2A是正常胸腺組織的透射電鏡。淋巴細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核大，細(xì)胞質(zhì)少。圖2B是凋亡早期胸腺淋巴細(xì)胞的透射電鏡圖，染色質(zhì)濃縮，周?chē)?。?xì)胞質(zhì)開(kāi)始凝結(jié)，細(xì)胞輪廓不規(guī)則。箭頭表示細(xì)胞核的碎片。圖2C顯示了含有細(xì)胞器的膜結(jié)合細(xì)胞質(zhì)在“萌芽”或擠壓過(guò)程中的凋亡淋巴細(xì)胞(箭頭)。一旦萌芽發(fā)生，這個(gè)擠出的片段將是一個(gè)“凋亡體”。這些凋亡小體是膜結(jié)合的，因此不會(huì)將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物釋放到間質(zhì)中。圖2D為胸腺切片的不同凋亡階段的淋巴細(xì)胞的電鏡圖。顯微照片中央的大細(xì)胞是吞噬細(xì)胞質(zhì)內(nèi)凋亡小體的巨噬細(xì)胞。
細(xì)胞凋亡的機(jī)制是非常復(fù)雜的，涉及到能量依賴(lài)的分子級(jí)聯(lián)事件(圖3)。迄今為止，研究表明有兩種主要的凋亡途徑:外部(死亡受體途徑)和內(nèi)部(線(xiàn)粒體途徑)。然而，現(xiàn)在有證據(jù)表明這兩種途徑是相互聯(lián)系的，其中一種途徑中的分子可以影響另一種途徑。還有一個(gè)額外的途徑涉及T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和穿孔素顆粒酶依賴(lài)性的細(xì)胞殺傷。穿孔素/顆粒酶通路可以通過(guò)顆粒酶B或顆粒酶A誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。外源性、內(nèi)源性和顆粒酶B通路都匯聚在同一個(gè)終端或執(zhí)行通路上。該途徑由caspase-3的切割啟動(dòng)，導(dǎo)致DNA碎片、細(xì)胞骨架和核蛋白的降解、蛋白的交聯(lián)、凋亡小體的形成、吞噬細(xì)胞受體配體的表達(dá)，最后被吞噬細(xì)胞攝取。顆粒酶A途徑通過(guò)單鏈DNA損傷激活平行的caspase獨(dú)立細(xì)胞死亡途徑。
生化特征：凋亡細(xì)胞表現(xiàn)出幾種生化修飾，如蛋白質(zhì)切割、蛋白質(zhì)交聯(lián)、DNA分解和吞噬識(shí)別，這些共同導(dǎo)致了前面描述的獨(dú)特的結(jié)構(gòu)病理。在大多數(shù)細(xì)胞中，Caspases（半胱天冬酶）以一種不活躍的原酶形式廣泛表達(dá)，一旦被激活，通?？梢约せ钇渌陌腚滋於?，允許蛋白酶級(jí)聯(lián)的啟動(dòng)。一些caspase前體也可以聚合和自動(dòng)激活。這種蛋白水解級(jí)聯(lián)，其中一個(gè)caspase可以激活其他caspase，放大了凋亡信號(hào)通路，從而導(dǎo)致快速細(xì)胞死亡。盡管不同的半胱天冬酶對(duì)鄰近氨基酸的識(shí)別具有不同的特異性，但它具有蛋白水解活性，能夠裂解天冬氨酸殘基上的蛋白質(zhì)。一旦caspase最初被激活，細(xì)胞死亡似乎是不可逆轉(zhuǎn)的。
圖3。凋亡事件示意圖。細(xì)胞凋亡的兩種主要途徑是內(nèi)源性和外源性以及穿孔素/顆粒酶途徑。每一種都需要特定的觸發(fā)信號(hào)來(lái)啟動(dòng)依賴(lài)能量的分子級(jí)聯(lián)事件。每個(gè)通路都激活自己的啟動(dòng)子caspase(8,9,10)，進(jìn)而激活caspase-3。然而，顆粒酶A以caspase獨(dú)立的方式工作。執(zhí)行途徑導(dǎo)致典型的細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征，包括細(xì)胞收縮、染色質(zhì)凝結(jié)、細(xì)胞質(zhì)泡和凋亡小體的形成，最后凋亡小體被鄰近的實(shí)質(zhì)細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞或巨噬細(xì)胞吞噬。
形態(tài)學(xué)檢測(cè)
如圖1，2所展示，可以進(jìn)行染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察，也可以電鏡下觀察凋亡的形態(tài)學(xué)變化。
DNA片段化相關(guān)檢測(cè)
DNA技術(shù)被用來(lái)可視化凋亡的內(nèi)切酶裂解產(chǎn)物。該方法包括從溶解的細(xì)胞勻漿中提取DNA，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。這就形成了一個(gè)有特色的“DNA階梯”，階梯中的每個(gè)條帶在大小上被大約180個(gè)堿基對(duì)隔開(kāi)。該方法操作簡(jiǎn)單，適用于每組織質(zhì)量或體積中凋亡細(xì)胞數(shù)量較高的組織和細(xì)胞培養(yǎng)物。另一方面，不建議在凋亡細(xì)胞數(shù)量較少的情況下使用。這種試驗(yàn)還有其他缺點(diǎn)。由于DNA碎裂發(fā)生在細(xì)胞凋亡的后期，DNA階梯的缺失并不能消除細(xì)胞發(fā)生早期凋亡的可能性。此外，在制備過(guò)程中可能會(huì)發(fā)生DNA碎片，使核小體梯難以產(chǎn)生，壞死細(xì)胞也會(huì)產(chǎn)生DNA碎片。
TUNEL (Terminal dUTP Nick End-Labeling)方法被用于通過(guò)酶標(biāo)記DNA鏈斷裂的末端來(lái)測(cè)定內(nèi)切酶裂解產(chǎn)物。末端轉(zhuǎn)移酶用于將標(biāo)記的UTP添加到DNA片段的3'端。然后可以用各種探針對(duì)dUTP進(jìn)行標(biāo)記，以便用光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡或流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。TUNEL檢測(cè)法可以通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞，也可以通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)約100個(gè)細(xì)胞。這也是一種快速的技術(shù)，可以在3小時(shí)內(nèi)完成。
圖4：Tunel檢測(cè)法示意圖
膜的改變的相關(guān)檢測(cè)
膜的改變凋亡細(xì)胞外質(zhì)膜上磷脂酰絲氨酸殘基的外化使得通過(guò)組織、胚胎或培養(yǎng)細(xì)胞中的Annexin V進(jìn)行檢測(cè)。一旦凋亡細(xì)胞與FITC標(biāo)記的Annexin V結(jié)合，就可以用熒光顯微鏡觀察到它們。其優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，可以檢測(cè)單個(gè)凋亡細(xì)胞，缺點(diǎn)是壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜也會(huì)被標(biāo)記出來(lái)。因此，關(guān)鍵點(diǎn)是顯示磷脂酰絲氨酸陽(yáng)性細(xì)胞的膜完整性。由于細(xì)胞膜完整性的喪失是壞死細(xì)胞的一個(gè)病理特征，因此壞死細(xì)胞會(huì)被特定的膜非滲透核酸染料染色，如碘化丙啶和臺(tái)盼藍(lán)。隨著細(xì)胞的染料積累和體積縮小，細(xì)胞的染料含量變得更集中，可以用光學(xué)顯微鏡觀察。這種染料吸收生物測(cè)定法適用于細(xì)胞培養(yǎng)，不標(biāo)記壞死細(xì)胞，具有高水平的靈敏度(可以檢測(cè)單個(gè)凋亡細(xì)胞)。
圖5：Annexin V /PI雙染色法檢測(cè)的原理
以上總結(jié)的是常用的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法，細(xì)胞凋亡就是凋亡通路中的各種分子促成的，不能因?yàn)闄z測(cè)單一指標(biāo)就輕易斷定凋亡的發(fā)生。畢竟，細(xì)胞凋亡事件中，每個(gè)指證只維持一段時(shí)間，因而各位小伙伴們最好能在不同時(shí)間段進(jìn)行多指標(biāo)的同時(shí)檢測(cè)，這才能確定凋亡的發(fā)生。最后為了不造成假陽(yáng)性和假陰性，陽(yáng)性和陰性對(duì)照也是必不可少的，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。 為回饋大家對(duì)翌圣生物細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑的支持，正在進(jìn)行包括凋亡檢測(cè)試劑在內(nèi)的細(xì)胞類(lèi)產(chǎn)品的促銷(xiāo)活動(dòng)，請(qǐng)直接與當(dāng)?shù)劁N(xiāo)售聯(lián)系獲取最新促銷(xiāo)信息。
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產(chǎn)品名稱(chēng) |
貨號(hào) |
規(guī)格 |
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40302ES20/50/60 |
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40303ES20/50/6 |
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40304ES20/50/6 |
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40305ES20/50/6 |
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40306ES20/50/6 |
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40307ES20/50/6 |
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40308ES20/50/6 |
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40310ES20/50/6 |
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40706ES60 |
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40752ES60 |
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