上回我們講到載體與目的片段的制備就戛然而止了。載體與目的片段制備成功之后剩下的就是連接跟轉(zhuǎn)化。

一步法同源重組原理上期我們已經(jīng)講過。接下來就該進行反應(yīng)體系的計算，很多小伙伴在這一關(guān)就被難住了。反應(yīng)體系的配置需要根據(jù)載體的堿基數(shù)以及插入片段的堿基數(shù)進行計算，不同公司的產(chǎn)品推薦的體系配置略微不同。這里就以翌圣的Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit（Cat.10922ES）為例，給大家講解Hieff Clone® 重組反應(yīng)體系如何配置。

Hieff Clone® 重組反應(yīng)體系最適片段及載體插入總量為0.02-1 pmol，1-3片段為0.02-0.5 pmol，4-6片段為0.5-1 pmol。最適載體與插入片段摩爾比為1:3。對應(yīng)的DNA質(zhì)量可由以下公式計算獲得：

線性化載體使用量ng = (插入堿基對數(shù)×0.65×總pmol) / (1＋3n)

插入片段使用量ng = (插入堿基對數(shù)×0.65×總pmol×3) / (1＋3n)

其中n表示插入目的片段數(shù)量。

舉個例子：我們需將4個片段P1 (0.5kb)、P2 (1kb)、P3 (2kb)、P4 (3kb)插入長為5kb的載體中，取載體與片段總量為1pmol為例進行計算：

線性化載體最適用量為：(5000×0.65×1)/13 = 250 ng

插入片段P1最適用量為：(500×0.65×1)/13 = 25 ng

插入片段P2最適用量為：(1000×0.65×1)/13 = 50 ng

插入片段P3最適用量為：(2000×0.65×1)/13 = 100 ng

插入片段P4最適用量為：(3000×0.65×1)/13 = 150 ng

除了以上這些，這里有個小技巧分享給大家：計算好體系后，加入線性化載體和插入片段后，可以先42℃高溫加熱，促進分子擴散，增加我們的載體與插入片段碰到的機率，再快速冷卻，最后加入含酶的Mix，混勻之后放入PCR儀器中進行反應(yīng)。反應(yīng)完的產(chǎn)物要盡快進行下一步實驗，避免常溫長時間放置。

轉(zhuǎn)化一般分為化學(xué)轉(zhuǎn)化和電轉(zhuǎn)化兩種。1970年Mandel和Hige發(fā)現(xiàn)大腸桿菌細胞經(jīng)CaCl2溶液處理時能夠吸收λ噬菌體DNA，細胞這種能夠吸收DNA的狀態(tài)稱感受態(tài)。常見的兩種轉(zhuǎn)化如下圖所示。

化學(xué)轉(zhuǎn)化相信大家已經(jīng)做過很多次，但是這里面始終有許多值得注意的小細節(jié)。將酶連產(chǎn)物加入到感受態(tài)細胞中的時候，要注意將移液槍的槍頭置于液面以下，不要反復(fù)吸打避免造成本就脆弱的感受態(tài)細胞死亡。整個操作過程注意在冰上操作并且無菌。細胞化學(xué)轉(zhuǎn)化的實驗操作步驟如下圖所示：

有些同學(xué)會出現(xiàn)平板上不長轉(zhuǎn)化子或轉(zhuǎn)化子很少的情況，那么該如何分析呢？首先思考一下培養(yǎng)基的問題，若培養(yǎng)基各組分添加的過多或過少以及培養(yǎng)基中抗生素類別使用錯誤或濃度使用過高，都會導(dǎo)致平板上不長或少長克隆。排除培養(yǎng)基的問題之后，再考慮使用的感受態(tài)是否存在效率低的問題。這個就要求我們在做實驗的時候養(yǎng)好做正負對照的習(xí)慣。我們將未線性化的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞中，并涂布在含抗生素的平板上作正對照。既可以排除感受態(tài)效率問題又可以排除培養(yǎng)基的問題。若整個操作過程一致，但正對照長，實驗組不長，則需要考慮我們的整個酶連過程是否存在問題。若正對照和實驗組都沒有克隆，則需要檢測操作過程是否出現(xiàn)錯誤或漏掉實驗步驟等。

往期回顧：克隆的那些事（上）

點擊產(chǎn)品名稱查看詳情