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      漲知識|克隆專題一：不同分子克隆方法介紹(上)
       
       
      


      

      

      

      

      

      

      克隆是英文“clone”或“cloning”的音譯，而英文“clone”則起源于希臘文“Klone”，原意是指以幼苗或嫩枝插條。1963年J.B.S.Haldane在題為“人類種族在未來二萬年的生物可能性”的演講上采用“克隆（Clone）”的術(shù)語，把“克隆技術(shù)”帶到了人們的視野中。
      


       
      


      克隆技術(shù)又稱為“生物放大技術(shù)”，目前應(yīng)用最廣泛的技術(shù)為“分子克隆”，又稱重組DNA技術(shù)，即通過重組技術(shù)將目的DNA片段按照人們的設(shè)計定向連接起來，在特定的受體細胞中與載體同時復(fù)制并得到表達，產(chǎn)生新的遺傳性狀的技術(shù)。
      


       
      


      隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入，分子克隆技術(shù)也隨之更新迭代，從傳統(tǒng)的依賴限制性內(nèi)切酶的方法發(fā)展到如今的TA克隆、TOPO克隆、無縫克隆、Gateway技術(shù)等等，新的技術(shù)不斷涌現(xiàn)，為分子生物學(xué)的發(fā)展和進化提供新的力量。今天小翌就帶領(lǐng)大家認識一下不同的分子克隆方法。
      

      

      

      

      


       
      

      


      

      

      

      01
      


      

      傳統(tǒng)分子克隆技術(shù)
      

      

      

      

      


      

      傳統(tǒng)分子克隆技術(shù)的依賴于限制性內(nèi)切酶和酶切位點。主要步驟是通過限制性內(nèi)切酶（翌圣的FuniCut™快速限制性內(nèi)切酶Cat#15001ES-15051ES）酶切載體和目的基因，通過連接酶（翌圣T4 DNA連接酶Cat#10300）將酶切的片段拼接在一起（即連接過程），形成可以表達目的基因的新載體（即重組質(zhì)粒），使用轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞中，進而實現(xiàn)目的基因的擴增、轉(zhuǎn)錄和翻譯。
      


       
      

      


      

      傳統(tǒng)分子克隆實驗流程如下圖：
      

      


      

      

      


      

      圖1.傳統(tǒng)分子克隆實驗流程
      


       
      

      


      

      該技術(shù)最早由Cohen Group在1973年實現(xiàn)，他們將E.coli的tetr質(zhì)粒psclol和nersrR6-3質(zhì)粒體外限制酶切割，連接成新的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coli，在含四環(huán)素和新霉素的平板上篩選出了terrNer，實現(xiàn)了細菌遺傳性狀的轉(zhuǎn)移。傳統(tǒng)分子克隆技術(shù)較為成熟，但是該方法受到限制性酶切位點和連接效率等方面的限制，并不能高效、準(zhǔn)確的克隆需要的目的基因。
      

      


      

       
      


      

      


      

      圖2. Stanley Cohen和Herbert Boyer（第一個成功實現(xiàn)基因工程技術(shù)的團隊）
      

      


      

       
      


      

      

      

      02
      


      

      TA克隆
      

      

      

      

      


      TA克?。∣riginal TA Cloning Kit），依賴于PCR反應(yīng)中所使用的聚合酶具有末端轉(zhuǎn)移的活性，通常在克隆片段的3’末端加上A尾（即3’-A），通過連接酶（翌圣T4 DNA連接酶Cat#10300）把克隆片段與一個具有3’-T突出的載體DNA連接起來。主要應(yīng)用于不清楚目的基因DNA序列的實驗，通過TA克隆重組到T-載體后，使用T-載體的上下游引物擴增片段，測序，最終確定目的基因序列。其中，聚合酶的選擇尤為重要，翌圣普通PCR試劑盒（Cat#10102/10103/10157）、翌圣快速PCR試劑盒（Cat#10157）均具有Taq DNA聚合酶，擴增后的PCR產(chǎn)物具有3’-dA突出端，可輕松克隆至T載體。
      


       
      

      


      

      

      


      

      圖3. TA克隆流程示意圖【3】
      


       
      

      


      

      

      

      03
      


      

      TOPO克隆
      

      

      

      

      


      

      TOPO克隆技術(shù)是通過TOPO載體上偶聯(lián)的異構(gòu)酶(Topoisomerase)實現(xiàn)插入片段的快速克隆。其原理是利用Topo載體兩端通過磷酸鍵偶聯(lián)的Topo酶，在連接反應(yīng)中，受插入片段的5'端羥基的攻擊，磷酸鍵釋放能量。利用該能量，插入片段5'端羥基與載體片段3'端磷酸基團連接在一起，Topo異構(gòu)酶從載體分子上脫落，完成連接反應(yīng)。不同于傳統(tǒng)的TA克隆，TOPO克隆能夠在2-5 min內(nèi)快速完成插入片段和載體的連接反應(yīng)，操作簡單，連接效率極高。
      

      


      

       
      


      


      圖4. TOPO克隆原理
      

      


      

       
      


      目前市面上的產(chǎn)品，需根據(jù)DNA片段末端的不同，選擇不同的TOPO克隆試劑盒。而翌圣新品零背景通用型TOPO克隆試劑盒（Cat#10906），能夠兼容平末端產(chǎn)物或粘性末端產(chǎn)物，不受片段末端影響，快速克隆連接，效率高，陽性率接近100%，如圖5所示。
      

      


      

      


      圖5. TOPO TA/Blunt克隆試劑盒輕松連接2 kb（10 ng）平末端/粘性末端片段
      
注：A&B：TOPO克隆轉(zhuǎn)化平板。C&D：插入片段PCR鑒定電泳圖。
      

      


      

       
      


      

      

      

      04
      


      

      無縫克隆技術(shù)
      

      

      

      

      


      傳統(tǒng)克隆和TA克隆兩種方法費時費力，過程繁冗，為了解決限制性酶切位點的限制，科學(xué)家們研發(fā)出新的、快速、簡潔、高效的克隆技術(shù)——無縫克隆，區(qū)別于傳統(tǒng)分子克隆，唯一的差異在于載體末端和引物末端應(yīng)具有15-20個同源堿基，由此得到的PCR產(chǎn)物兩端便分別帶上15-20個與載體序列同源性的堿基，依靠堿基間作用力互補配對成環(huán)，不經(jīng)過酶切，PCR產(chǎn)物和線性化載體在同源重組酶的作用下，經(jīng)過一定的時間和溫度即可進行轉(zhuǎn)化，完成定向克隆。
      

      


      

       
      


      

      


      

      圖6.同源重組原理
      

      


      

       
      


      無縫克隆技術(shù)最早是2009年由Daniel Gibson和J. Craig Venter發(fā)展起來，廣泛應(yīng)用的方法包括兩種Gibson Assembly和In-Fusion Cloning，原理都是通過外切酶產(chǎn)生黏性末端，再通過同源重組酶的連接得到重組片段，但是兩種方法的外切酶完全不同，形成重組序列的方式也不一樣。
      



      
Gibson Assembly：包含T5 exonuclease、Phusion DNA polymerase和Taq DNA Ligase三種酶，通過5’→3’ T5核酸外切酶活性，沿著5’→3’方向降解dsDNA，產(chǎn)生3’黏性末端，通過同源臂互補配對，退火后借助Phusion DNA聚合酶修復(fù)片段上的缺口，Taq DNA連接酶催化片段形成磷酸二酯鍵，將所有缺口補齊，獲得重組片段。
      


       
      

      


      

      


      圖7. Gibson Assembly原理圖【5】
      

      


      

       
      


      In-Fusion Cloning：具有3’→5’ 核酸外切酶，能夠識別3’末端堿基，沿著3’→5’ 方向降解dsDNA，產(chǎn)生5’黏性末端，同源臂互補，退火后配對，因為其不含連接酶，所以要將重組片段轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞內(nèi)，序列中的缺口會在感受態(tài)體內(nèi)補平、連接，獲得重組片段。
      

      


      

       
      


      


      圖8. In-Fusion Cloning原理【6】
      

      


      

       
      


      翌圣同源重組試劑盒利用無縫克隆技術(shù)，僅需50℃反應(yīng)20 min即可轉(zhuǎn)化，完成定向克隆，克隆陽性率可達95%以上。其中，翌圣一步法快速克隆試劑盒（Cat#10911ES）可連接單片段，該試劑盒已發(fā)文章累計IF達到1000+。翌圣通用型一步法快速克隆試劑盒（Cat#10922ES）可連接1-6片段，最長連接片段可達23 kb，是多片段連接的不二之選。
      

      


      

       
      


      通過上述的介紹，相信大家已經(jīng)初步了解了目前實驗室中常用的分子克隆技術(shù)，那么還有哪些新開發(fā)的分子克隆技術(shù)呢？無縫克隆中不常見、特殊的分子克隆技術(shù)又有哪些呢？關(guān)注我們，小翌會在下一期的分子克隆技術(shù)專題中，給大家介紹新的分子克隆技術(shù)，為您的實驗帶來新的思路與方向，期待下一次的見面~
      


       
      


      

      

      

      05
      


      

      相關(guān)產(chǎn)品列表
      

      

      

      

      


       
      


      
	
		
      
			
			
      產(chǎn)品定位
      
			      		
			
			
      產(chǎn)品名稱
      
			      		
			
			
      產(chǎn)品貨號
      
			      		
			
			
      規(guī)格
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      通用緩沖液，5min完成精準(zhǔn)酶切 
      
			      		
			
			
      FuniCut™快速限制性內(nèi)切酶
      
			      		
			
			
       15001ES-15051ES 
      
			      		
			
			
      50 T 
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      常規(guī)PCR 
      
			      		
			
			
      2×Hieff® PCR Master Mix(With Dye) 
      
			      		
			
			
      10102ES03/08 
      
			      		
			
			
      1 mL/5×1 mL 
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      常規(guī)PCR，不含染料 
      
			      		
			
			
      2×Hieff® PCR Master Mix(No Dye) 
      
			      		
			
			
      10103ES03/08 
      
			      		
			
			
      1 mL/5×1 mL 
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      快速PCR，快至1s/kb 
      
			      		
			
			
      2×Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix(with Dye) 
      
			      		
			
			
      10157ES03/08 
      
			      		
			
			
      1 mL/5×1 mL 
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      TOPO克隆-兼容TA/平末端 
      
			      		
			
			
      Hieff Clone® Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit 
      
			      		
			
			
      10906ES20 
      
			      		
			
			
      20 T 
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      TOPO克隆-TA末端 
      
			      		
			
			
      Hieff Clone® Zero TOPO-TA Cloning Kit 零背景TOPO-TA克隆試劑盒 
      
			      		
			
			
      10907ES20 
      
			      		
			
			
      20 T 
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      TOPO克隆-平末端 
      
			      		
			
			
      Hieff Clone® Zero TOPO-Blunt Cloning Kit 
      
			      		
			
			
      10909ES20 
      
			      		
			
			
      20 T 
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      單片段一步克隆，已發(fā)文章累計IF達到1000+ 
      
			      		
			
			
      Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit一步法快速克隆試劑盒 
      
			      		
			
			
      10911ES20/50
      
			      		
			
			
      20 T/50 T 
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      1-6片段一步克隆，最快5分鐘完成重組反應(yīng) 
      
			      		
			
			
      Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit通用型一步法快速克隆試劑盒 
      
			      		
			
			
      10922ES20/50 
      
			      		
			
			
      20 T/50 T 
      
			      		
		
      
	      

      


       
      

      


      

      參考文獻
      

      


      

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      400-6111-883