抗體親和純化系列——抗體純化，不二之選
Protein A、Protein G、Protein L背景介紹
Protein A、Protein G是最常應(yīng)用于抗體親和純化和免疫沉淀的蛋白。將Protein A、G分別固定在不同的介質(zhì)上，或同時(shí)將Protein A、G共價(jià)偶聯(lián)到介質(zhì)表面，是從腹水、細(xì)胞培養(yǎng)物上清和血清中分離IgG和IgG亞家族的有效工具。
將蛋白樣本Protein A和Protein G純化IgG，IgG片段和亞類的基礎(chǔ)是二者對(duì)IgG-類型的多克隆抗體和單克隆抗體具有很高的特異性親和力。
圖1.Protein A、G親和性
Protein L源于細(xì)菌，能更廣泛地結(jié)合各種類型以及亞類的免疫球蛋白，包括所有類型的IgG和單鏈可變區(qū)(ScFv)以及Fab片段。該蛋白只與抗體的kappa鏈結(jié)合而不會(huì)影響抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，這一特性使其與蛋白A或蛋白G相比，能更廣泛地結(jié)合各種來源及亞類的抗體。
Yeasen生物提供一系列以蛋白A、蛋白G與蛋白L為核心的抗體純化工具，涵蓋不同類型填料樹脂及自動(dòng)層析預(yù)裝柱，方便使用手動(dòng)或自動(dòng)化方式純化抗體蛋白質(zhì)。
Protein A、G、L樹脂的差異分析
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Beads |
Protein A |
Protein G |
Protein A/G |
Protein L |
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優(yōu)點(diǎn) |
高流速； 結(jié)合能力強(qiáng)； 特異性與IgG的Fc片段結(jié)合 |
高流速； 結(jié)合能力強(qiáng)； 與IgG的Fc和Fab片段結(jié)合 |
高流速； 結(jié)合范圍更廣，兼容A\G共同點(diǎn)； 結(jié)合能力更強(qiáng)； 實(shí)用性更高 |
幾乎可以結(jié)合所有的Ig類(IgG，IgM，IgA，IgE和IgD)； 還可以結(jié)合單個(gè)輕鏈（Scfv）和Fab片段 |
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缺點(diǎn) |
宿主細(xì)胞蛋白的一些非特異性結(jié)合 |
不能像蛋白A一樣耐受苛刻的洗脫條件 |
不結(jié)合牛、山羊或綿羊來源的免疫球蛋白 |
附表1是關(guān)于蛋白A和蛋白G對(duì)于不同的免疫球蛋白相對(duì)結(jié)合力的比較，可用于預(yù)測(cè)蛋白A或蛋白G作為親和介質(zhì)時(shí)的選用指導(dǎo)。對(duì)于來自特別物種IgG的最佳結(jié)合條件，應(yīng)該查閱近期的文獻(xiàn)，獲得最有價(jià)值的信息。
翌圣純化產(chǎn)品選擇指南
Yeasen生物抗體純化類工具，以基因改造后的Protein A/G、Protein L為原料，通過不同化學(xué)方法將其定向、高效的偶聯(lián)到瓊脂糖基質(zhì)上，不僅降低了蛋白的非特異性結(jié)合、實(shí)現(xiàn)了樹脂較高的抗體載量，同時(shí)也獲得了適用于不同純化要求的抗體純化產(chǎn)品。
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產(chǎn)品系列 |
普通型純化樹脂系列 |
快速型純化樹脂系列 |
預(yù)裝柱系列 |
磁珠系列 |
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Protein A、G 、A/G、L Agarose |
Protein A、G 、A/G、L 4FF Agarose |
Protein A、G、L 4FF Chromatography Column |
Protein A/G MagBeads (IP Grade) |
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平均粒徑d50V |
45-165µm |
45-165µm |
45-165µm |
1μm |
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配基 |
重組蛋白 |
重組耐堿蛋白 |
重組耐堿蛋白 |
重組Protein A/G |
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載量 |
Protein A > 40mg人IgG/mL Protein G > 30mg人IgG/mL Protein A/G > 20mg人IgG/mL Protein L > 15mg人IgG/mL |
＞50µg人IgG /mg |
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最大操作壓力 |
0.1MPa,1bar |
0.3MPa,3bar |
0.3MPa,3bar |
- |
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支撐物 |
4%瓊脂糖微球 |
高度交聯(lián)4%瓊脂糖微球 |
高度交聯(lián)4%瓊脂糖微球 |
聚合物磁性微球 |
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優(yōu)勢(shì) |
非特異性結(jié)合低，高載量 |
非特異性結(jié)合極低，高載量高流速，強(qiáng)穩(wěn)定性 |
柱效穩(wěn)定，高載量，高流速，強(qiáng)穩(wěn)定性 標(biāo)準(zhǔn)接口適配商品化各類中壓色譜系統(tǒng) |
高純度，高載量，高特異性，配套磁力架使用方便 |
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推薦應(yīng)用 |
任意規(guī)?？贵w純化 |
任意規(guī)?？贵w純化，IP，COIP |
小規(guī)模抗體純化 |
抗體純化，重組蛋白純化，IP，COIP |
純化方法
親和純化是一種具有可逆反應(yīng)的生化分離純化技術(shù)，如抗原與抗體。適用于從成分復(fù)雜且雜質(zhì)含量遠(yuǎn)大于目標(biāo)物的混合物中提純目標(biāo)物。如圖1所示，首先填料與介質(zhì)偶聯(lián)，結(jié)合形成具有特異親和性的分離介質(zhì)，再向柱子中注入樣本，配體選擇性的吸附目標(biāo)物質(zhì)，平衡液洗雜，最終用洗脫液將目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行洗脫。
圖2. 親和層析示意圖
純化實(shí)例
即使使用結(jié)合鼠單抗IgG1比較弱的Protein A 1mL預(yù)裝柱，純化效率也高于90%。
圖3. Protein A純化結(jié)果示意圖
FAQ
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常見問題 |
原因分析 |
推薦解決方案 |
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柱子反壓過高 |
篩板堵塞 |
清洗或更換篩板 |
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填料堵塞 |
參照說明書樹脂清洗 |
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裂解液中含有微小的固體顆粒，建議上柱前使用濾膜 (0.22或0.45μm)過濾，或者離心去除 |
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樣品純化過程中曲線不穩(wěn)定 |
樣品或Buffer中含氣泡 |
去除樣品或柱子中的氣泡 |
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樣品和buffer進(jìn)行脫氣 |
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洗脫組分中沒有目的蛋白 |
樣品中抗體濃度太低 |
適當(dāng)提、高抗體濃度 |
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抗體被降解 |
蛋白洗脫后應(yīng)立即中和，適當(dāng)提高洗脫液pH |
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樣本與純化介質(zhì)柱不匹配 |
參照表1選擇合適的純化介質(zhì) |
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電泳loading buffer DTT失效 |
使用新鮮配制loading buffer |
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洗脫緩沖液pH不對(duì) |
依次用pH3.0, pH 2.5, pH 2.0洗脫，電泳檢測(cè)產(chǎn)物 |
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結(jié)合緩沖液pH不對(duì) |
應(yīng)保證樣本和結(jié)合緩沖液pH在7.0 |
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回收率逐漸降低 |
上樣量過多 |
減少上樣量 |
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柱子太臟，載量降低 |
參照說明書進(jìn)行樹脂清洗 |
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樣本中脂蛋白、酚紅、小分子污染物等的去除 |
每毫升樣品中加入0.04mL硫酸右旋葡糖酐和1mL 1M CaCl2沉淀脂蛋白，離心除去 |
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PVP加入樣品中至終濃度為3%沉淀b-脂蛋白和球蛋白，離心去除 |
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結(jié)合緩沖液稀釋樣本 |
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脫鹽柱除去酚紅 |
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分級(jí)沉淀法去除低分子污染物，可采用硫酸銨沉淀，羊脂酸沉淀等方法 |
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抗體藥物純化過程中，降低聚集體含量 |
在上游細(xì)胞培養(yǎng)，控制最佳的收獲時(shí)機(jī)，避免培養(yǎng)過程中抗體聚集 |
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低pH洗脫液中，加入保護(hù)劑（Arg等） |
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低pH洗脫后，快速中和 |
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適當(dāng)降低親和層析柱進(jìn)樣量 |
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樣品處理和純化過程中，保持低溫（4-8℃） |
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訂購信息
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產(chǎn)品名稱 |
貨號(hào) |
規(guī)格（mL） |
價(jià)格（元） |
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36401ES08/25/60 |
5 /25 /100 |
546/2186/7426 |
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36402ES08/25/60 |
5 /25 /100 |
866/2656/8856 |
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36403ES03/05/08/25/60 |
1/2/5/25/100 |
278/538/878/2886/7426 |
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36404ES08/25/60 |
5 /25 /100 |
978/3186/8726 |
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36405ES08/25/60 |
5 /25 /100 |
546/2186/7426 |
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36406ES08/25/60 |
5 /25 /100 |
978/3186/8726 |
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36407ES08/25/60 |
5 /25 /100 |
2488/9988/16488 |
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36408ES08/25/60 |
5 /25 /100 |
2868/13288/27688 |
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36409ES03/08 |
1 mL/5×1 mL |
528/2218 |
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36410ES08/25 |
5 mL/5×5 mL |
1848/6838 |
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36413ES03/08 |
1 mL/5×1 mL |
528/2218 |
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36414ES08/25 |
5 mL/5×5 mL |
1848/6838 |
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36415ES03/08 |
1 mL/5×1 mL |
938/3748 |
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36416ES08/25 |
5 mL/5×5 mL |
3528/14088 |
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36417ES03/08 |
1/5 |
787/2937 |
參考文獻(xiàn)
[1] Gao L, Guo Q, Li X, et al. MiR-873/PD-L1 axis regulates the stemness of breast cancer cells[J]. EBioMedicine, 2019, 41: 395-407.
[2] Jiang S, Liu Y, Shen Z, et al. Acetylome profiling reveals extensive involvement of lysine acetylation in the conversion of muscle to meat[J]. Journal of proteomics, 2019, 205: 103412.
[3] Chen Y, Tang J, Lu T, Liu F. CAPN1 promotes malignant behavior and erlotinib resistance mediated by phosphorylation of c-Met and PIK3R2 via degrading PTPN1 in lung adenocarcinoma. Thorac Cancer. 2020;11(7):1848-1860 Protein A/G MagBeads IF: 2.61
[4] Zhao Q, Liu Y, Wang T, et al. MiR-375 inhibits the stemness of breast cancer cells by blocking the JAK2/STAT3 signaling [published online ahead of print, 2020 Jul 30]. Eur J Pharmacol. 2020;884:173359.
Protein A/G Agarose Resin IF: 3.263
附表:
附表1 蛋白A和蛋白G對(duì)不同免疫球蛋白的結(jié)合力
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免疫球蛋白來源 |
亞類 |
蛋白A結(jié)合力 |
蛋白G結(jié)合力 |
|
人類Human |
IgG |
+++ |
+++ |
|
IgG1 |
++++ |
++++ |
|
|
IgG2 |
++++ |
++++ |
|
|
IgG3 |
- |
+++ |
|
|
IgG4 |
++++ |
++++ |
|
|
IgA |
可變的 |
- |
|
|
IgA1 |
+ |
- |
|
|
IgA2 |
+ |
- |
|
|
IgD |
- |
- |
|
|
IgE |
++ |
- |
|
|
IgM |
+ |
- |
|
|
兔Rabbit |
IgG |
+++ |
+++ |
|
牛Cow |
IgG |
+ |
+++ |
|
IgG1 |
+ |
+++ |
|
|
IgG2 |
+++ |
+++ |
|
|
貓Cat |
IgG |
+++ |
+ |
|
馬Horse |
IgG |
++ |
++++ |
|
山羊Goat |
IgG |
+ |
++ |
|
IgG1 |
+ |
+++ |
|
|
IgG2 |
+++ |
+++ |
|
|
豚鼠Guinea pig |
IgG1 |
++ |
+ |
|
IgG2 |
++ |
+ |
|
|
綿羊Sheep |
IgG |
+ |
++ |
|
IgG1 |
+ |
++ |
|
|
IgG2 |
+++ |
+++ |
|
|
狗Dog |
++ |
+ |
|
|
豬Pig |
+++ |
++ |
|
|
大鼠Rat |
IgG |
+ |
++ |
|
IgG1 |
- |
+ |
|
|
IgG2a |
- |
++++ |
|
|
IgG2b |
- |
++ |
|
|
IgG2c |
++ |
++ |
|
|
IgG3 |
+ |
++ |
|
|
小鼠Mouse |
IgG |
++ |
++ |
|
IgG1 |
+ |
++++ |
|
|
IgG2a |
++++ |
++++ |
|
|
IgG2b |
+++ |
+++ |
|
|
IgG3 |
++ |
+++ |
|
|
IgM |
- |
- |
|
|
雞Chicken |
IgY |
- |
- |
|
恒河猴Monkey rhesus |
IgG |
++++ |
++++ |
|
倉鼠Hamster |
+ |
++ |
|
|
考拉Koala |
- |
+ |
|
|
美洲駝Llama |
- |
+ |
HB201215
