干貨分享|轉染效率低？小翌手把手教你做細胞轉染實驗
轉染效率是判斷細胞轉染成功的重要指標之一，受到諸多因素的影響，如核酸純度、細胞密度、生長狀態(tài)等等，本期為大家?guī)硗暾募毎D染原理與操作與問題的解決方案。
細胞膜是由磷脂雙分子層和鑲嵌蛋白組成的，帶有負電荷。因此帶有負電荷的DNA或RNA無法通過細胞膜。為了讓核酸（DNA或RNA）通過細胞膜，研究人員利用不同的方法，包括使用化學物質和包被核酸的載體分子進行中和，以及在細胞膜上開孔等物理方法，將核酸（DNA或RNA）直接運輸?shù)郊毎麅?nèi)。這些就是轉染的過程，轉染的目的是促進蛋白合成，調節(jié)基因表達，促進細胞生長與發(fā)育等，目前越來越多地被用到功能研究中。
圖1. DNA/RNA轉染過程
（圖片來源：圖片來源于網(wǎng)絡）
根據(jù)導入的核酸在目的細胞中存活時間的長短，可以將轉染技術分為瞬時轉染和穩(wěn)定轉染。也可以根據(jù)轉染方式的不同，分為化學轉染，物理轉染、和生物轉染方法。例如脂質體轉染、陽離子聚合物PEI轉染、電轉、顯微注射、以及慢病毒包裝轉染等等。
但是，沒有一種轉染試劑可以滿足所有的實驗要求。必須根據(jù)您的細胞類型（貼壁細胞、懸浮細胞）、外源核酸種類（DNA、RNA）、基因表達時間、細胞毒性、轉染效率等，操作是否簡便等因素，挑選出最理想的轉染試劑。
圖2. 不同轉染方法的原理和優(yōu)點
在細胞轉染過程中，即使選對了合適的細胞轉染試劑，還是不可避免會出現(xiàn)各種令人頭疼的問題，例如，轉染效率低，細胞死亡，重復性差等問題。對于這些問題，我們接下來會詳細剖析。
2.1 轉染前
1）核酸純度不夠，比如DNA/RNA不純、質粒中含有內(nèi)毒素、核酸不完整、核酸濃度過低均會導致轉染效率低。建議使用高純度的DNA或RNA有助于獲得較高的轉染效率。
2）要檢測所用的無血清培養(yǎng)基與轉染試劑的相容性，已知CD293, SFMII, VP-SFM 與轉染試劑不相容。
3）用了含有血清的培養(yǎng)基制備轉染復合物。血清會降低復合物的形成。建議用無血清培養(yǎng)基稀釋DNA/RNA和轉染試劑。
4）DNA或RNA的復合物形成的比例，一般DNA（µg）：轉染試劑（µL）=1:2~1:3；而RNA（ng）：轉染試劑（µL）=9:1~3:1。
5）復合物孵育時間過短，未能充分形成復合物。建議復合物孵育時間10~20 min。
6）轉染試劑保存不當，降低轉染效率。保存在4 ºC冰箱，不可凍存，避免反復長時間開蓋。
2.2 轉染時
7）細胞密度過低或過高。DNA轉染細胞密度90%~95%，RNA轉染細胞密度30%~50%。
8）細胞生長狀態(tài)不佳。清除支原體、真菌、細菌等污染，保證提供新鮮的生長培養(yǎng)基。
9）轉染時細胞上清液中含有抗生素、生長因子等，大大降低轉染效率。
2.3 轉染后
10) 轉染時間過短。一般質粒表達水平在24~48h，mRNA表達水平在24~72 h，蛋白表達水平在48~96 h。
3.1 轉染前
1）核酸純度不純也會造成細胞毒性。要確保質粒中無內(nèi)毒素，使用高純度的DNA或RNA會降低細胞毒性。
2）轉染試劑過量。優(yōu)化轉染試劑的用量，以及優(yōu)化復合物的比例。
3）要檢查稀釋復合物的培養(yǎng)基與細胞的相容性，已知DMEM培養(yǎng)基對一些昆蟲細胞系有毒性。建議選擇合適的培養(yǎng)基。
3.2 轉染時
4）細胞密度過低，會導致部分細胞死亡。DNA轉染細胞密度90%~95%，RNA轉染細胞密度30%-50%。
5）細胞生長狀態(tài)不佳。清除支原體、真菌、細菌等污染，保證提供新鮮的生長培養(yǎng)基。
3.3 轉染后
6）轉染后目的蛋白的過度表達對細胞產(chǎn)生毒性。建議及時更換新鮮培養(yǎng)基，或者添加一些營養(yǎng)物質。
7）轉染后表達蛋白對細胞產(chǎn)生毒性。建議換一種細胞系重新轉染。
8）轉染時間過短，就進行抗性篩選。一般質粒表達水平在24~48h，mRNA表達水平在24~72 h，蛋白表達水平在48~96 h。
9）抗性篩選時，加入的抗生素濃度過高。適當降低抗生素的濃度。
4.1 轉染前
1）移液誤差。將DNA/RNA和轉染試劑充分打勻后，用移液器緩慢均勻的吸取，避免產(chǎn)生誤差。
2）制備復合物時，未充分混勻。將DNA/RNA和轉染試劑輕輕混勻，并保證相同的孵育時間。
4.2 轉染時
3）細胞密度存在差異。一般在特定的密度范圍內(nèi)，細胞密度越低，轉染效率越低，相反越高。
4）細胞生長狀態(tài)存在差異。好的細胞狀態(tài)，轉染效率越高。
5）細胞傳代次數(shù)不同。對于多次傳代的細胞，細胞的基因組和表型都會發(fā)生變化，不建議使用傳代次數(shù)過多的細胞進行轉染實驗。
4.3 轉染后
6）轉染時間不一致，表達的蛋白水平會有差異。
已發(fā)表文章
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應用場景 |
名稱 |
貨號 |
規(guī)格 |
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細胞類型：貼壁/懸浮 核酸類型：DNA、siRNA |
40802ES02 |
0.5 mL |
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40802ES03 |
1.0 mL |
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40802ES08 |
5×1 mL |
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細胞類型：貼壁/懸浮 |
40803ES70 |
200 T |
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用途：病毒感染、DNA轉染 |
40804ES76 |
500 μL |
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40804ES86 |
5×500 μL |
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細胞類型：懸浮 |
40805ES02 |
0.5 mL |
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40805ES03 |
1.0 mL |
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40805ES08 |
5×1 mL |
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細胞類型：貼壁/懸浮 |
40806ES01 |
0.1 mL |
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|
40806ES02 |
0.5 mL |
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|
40806ES03 |
1.0 mL |
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|
細胞類型：貼壁/懸浮 |
40808ES02 |
0.5 mL |
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|
40808ES03 |
1 mL |
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|
40808ES08 |
5×1 mL |
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細胞類型：貼壁/懸浮 |
40809ES01 |
0.1 mL |
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40809ES03 |
1 mL |
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細胞類型：貼壁/懸浮 |
40815ES03 |
1 g |
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40815ES08 |
5×1 g |
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細胞類型：貼壁/懸浮 |
40816ES02 |
100 mg |
|
|
40816ES03 |
1 g |
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|
細胞類型：293 |
40820ES04 |
1.5 mL |
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|
40820ES10 |
10 mL |
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|
40820ES60 |
100 mL |
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細胞類型：293 核酸類型：DNA 用途：AAV/LV載體大規(guī)模生產(chǎn) |
40821ES10 |
10 mL |
|
|
40821ES60 |
100 mL |
||
|
40821ES80 |
1 L |
HB20200917
