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      細(xì)胞轉(zhuǎn)染注意事項,你都get了嗎?(下)

      細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗從開始設(shè)計到最終的效果檢測,可以由6個過程組成:核酸準(zhǔn)備、試劑選擇、細(xì)胞鋪板、轉(zhuǎn)染操作、細(xì)胞培養(yǎng)、效果檢測。每一步都會影響最終的結(jié)果,均存在不同的注意事項。上個月小翌分享了前3個過程的注意事項:

       

      細(xì)胞轉(zhuǎn)染注意事項,你都get了嗎?(上)

       

      微信圖片_20220516113636.png

       

      本期分享后面3個過程的注意事項:

       

      轉(zhuǎn)染操作

       

      1.條件摸索與優(yōu)化:

       
      不同的細(xì)胞及轉(zhuǎn)染試劑要求轉(zhuǎn)染的條件是不同的,同一種系的細(xì)胞株,在各實驗室不同培養(yǎng)條件下,其生物學(xué)性狀也會發(fā)生不同程度的改變,導(dǎo)致其轉(zhuǎn)染特性也發(fā)生變化。在進(jìn)行不同核酸或不同細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染時,需要再次優(yōu)化實驗條件。不同的培養(yǎng)體系、不同的核酸與試劑比例,最好是在第一次實驗前做一個預(yù)實驗。初學(xué)者通常都不會在乎加入的核酸量,甚至愿意多加點,但是要注意的是,核酸量過少固然轉(zhuǎn)染效率不高,但過多同樣會降低轉(zhuǎn)染效率。
       

      2.無血清配置復(fù)合物:

       
      通常在開始準(zhǔn)備核酸和轉(zhuǎn)染試劑稀釋液時要使用無血清的培養(yǎng)基或試劑自帶的組分,因為血清會影響復(fù)合物的形成。血清中含有大量的蛋白質(zhì),在轉(zhuǎn)染過程中,帶負(fù)電的蛋白質(zhì)可能干擾陽離子脂質(zhì)體/陽離子聚合物對核酸的吸附,影響轉(zhuǎn)染效率。現(xiàn)在市面上也有一些改進(jìn)了的轉(zhuǎn)染試劑,可以在轉(zhuǎn)染時含有血清。所以根據(jù)具體的試劑,操作上會有差異。
       

      3.孵育時間:

       
      不同的轉(zhuǎn)染試劑在核酸-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物形成中,需要時間不同,一般是5min-30min之間,要注意避免孵育時間過長。
       

      4.抗生素影響:

       
      在部分轉(zhuǎn)染試劑的使用中,要考慮抗生素的影響。這些抗生素一般對于真核細(xì)胞無毒,但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性,使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞,降低細(xì)胞的活性,導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低。
       
      細(xì)胞培養(yǎng)
       

      1.優(yōu)良的培養(yǎng)試劑:

       
      血清是一種包含生長因子及其它輔助因子的不確切成分的添加物,對不同細(xì)胞的生長作用有很大的差別。胎牛血清(FBS)經(jīng)常用到,便宜一點的有馬或牛血清。血清質(zhì)量的變化直接影響細(xì)胞生長,因此也會影響轉(zhuǎn)染效率。對于RNA轉(zhuǎn)染,如何消除血清中潛在的RNase污染也是值得關(guān)注的環(huán)節(jié)。
       

      2.是否換液:

       
      轉(zhuǎn)染時不加血清是防止血清的干擾作用,轉(zhuǎn)染后可適時加入,補充營養(yǎng)。加入過早會引起未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的優(yōu)勢生長,過晚會引起較多細(xì)胞死亡。可實時觀察1/5細(xì)胞變圓的時候加入血清。盡管有些轉(zhuǎn)染試劑號稱不需要換液,也能取得不錯的效果,但是為了使細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境更好,建議在轉(zhuǎn)染后6小時左右換有血清的培養(yǎng)基可能會更好。
       
      效果檢測
       

      1.檢測方法的選擇:

       
      對于轉(zhuǎn)染效果的驗證主要取決于實驗?zāi)康幕?蛋白的性質(zhì)。主要是mRNA和蛋白水平的驗證。mRNA水平可以使用普通PCR 或者定量PCR,前者是定性,后者定量。但是最主要的還是蛋白水平的檢測,如果是膜蛋白,那么流式檢測最方便;如果是胞外分泌型,那么用上清液做ELISA或者Western都可以;如果是胞漿分泌型的那么就用Western或者流式都可以。
       

      2.檢測時間的選擇:

       
      一般在轉(zhuǎn)染24-72h,靶基因即在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。根據(jù)不同的實驗?zāi)康模?4-48h后即可進(jìn)行靶基因表達(dá)的檢測實驗。轉(zhuǎn)染48~72h后可檢測蛋白表達(dá),如用于重組蛋白、抗體生產(chǎn)等。
       
      以siRNA為例,siRNA轉(zhuǎn)染后,在mRNA水平下降后,接下來才會有蛋白水平的下降,一般來說,轉(zhuǎn)染后48-72小時進(jìn)行蛋白檢測通常會得到較好的結(jié)果。
       

      3.穩(wěn)轉(zhuǎn)篩選:

       
      如若建立穩(wěn)定的細(xì)胞系,則可對靶細(xì)胞進(jìn)行篩選,根據(jù)不同基因載體中所含有的抗性標(biāo)志選用相應(yīng)的抗生素就行篩選,常用的真核表達(dá)基因載體的標(biāo)志物有潮霉素和新霉素等。
       
       
       
       
      目前翌圣轉(zhuǎn)染試劑系列的產(chǎn)品已經(jīng)榮登《Nature》 《Cell》等多個頂級期刊,獲得科研大牛們的認(rèn)可!
       
      IF55分!翌圣轉(zhuǎn)染試劑助力高分文章
      翌圣明星CP--轉(zhuǎn)染試劑與PCR產(chǎn)品又登《Cell》期刊
       
      以下僅展示部分論文: 
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      [1] Liu R, Yang J, et al. Optogenetic control of RNA function and metabolism using engineered light-switchable RNA-binding proteins. Nat Biotechnol. 2022 Jan 3. (IF:55)華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院楊弋團隊

      [2] Zhou J, Chen P, et al. Cas12a variants designed for lower genome-wide off-target effect through stringent PAM recognition. Mol Ther. 2022 Jan 5.(IF:11.454)武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院殷雷團隊

      [3] Chen S, Cao X, et al. circVAMP3 Drives CAPRIN1 Phase Separation and Inhibits Hepatocellular Carcinoma by Suppressing c-Myc Translation. Adv Sci (Weinh). 2022 Jan 24.(IF:16.808)中國科學(xué)院北京生命科學(xué)研究院趙方慶團隊

      [4] Gu C, Wang Y, et al. AHSA1 is a promising therapeutic target for cellular proliferation and proteasome inhibitor resistance in multiple myeloma. J Exp Clin Cancer Res. 2022 Jan 6.(11.161)南京中醫(yī)藥大學(xué)楊燁顧春艷團隊

      [5] Zhang Y, Yu X, et al. Splicing factor arginine/serine-rich 8 promotes multiple myeloma malignancy and bone lesion through alternative splicing of CACYBP and exosome-based cellular communication. Clin Transl Med. 2022 Feb.(11.492)南京中醫(yī)藥大學(xué)楊燁顧春艷團隊

      [6] Qin J, Cai Y, et al. Molecular mechanism of agonism and inverse agonism in ghrelin receptor. Nat Commun. 2022 Jan 13.(14.9)四川大學(xué)生物治療國家重點實驗室邵振華團隊

      [7] Tang X, Deng Z, et al. A novel protein encoded by circHNRNPU promotes multiple myeloma progression by regulating the bone marrow microenvironment and alternative splicing. J Exp Clin Cancer Res. 2022 Mar 8.(11.161)南京中醫(yī)藥大學(xué)楊燁顧春艷團隊

      [8] Xie F, Su P, et al. Engineering Extracellular Vesicles Enriched with Palmitoylated ACE2 as COVID-19 Therapy. Adv Mater. 2021 Oct 19. (IF:30.849)蘇州大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院周芳芳團隊和浙江大學(xué)生命科學(xué)研究院張龍團隊

      [9] Liang Y, Lu Q, et al. Reactivation of tumour suppressor in breast cancer by enhancer switching through NamiRNA network. Nucleic Acids Res. 2021 Sep 7.(IF:16.9)復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院于文強團隊

      [10] Fan Y, Wang J, et al. CircNR3C2 promotes HRD1-mediated tumor-suppressive effect via sponging miR-513a-3p in triple-negative breast cancer. Mol Cancer. 2021 Feb 2.(IF:27.403)南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院蘇東明團隊

      [11] Dai L, Dai Y, et al. Structural insight into BRCA1-BARD1 complex recruitment to damaged chromatin. Mol Cell. 2021 Jul 1.(IF:17.97)浙江大學(xué)生命科學(xué)研究院黃俊團隊和中科院生物物理所周政團隊

      [12] Zhang K, Wang A, et al. UBQLN2-HSP70 axis reduces poly-Gly-Ala aggregates and alleviates behavioral defects in the C9ORF72 animal model. Neuron. 2021 Jun 16.(IF:17.17)中國科學(xué)院生物與化學(xué)交叉研究中心王文元團隊

      [13] Li T, Chen X, et al. A synthetic BRET-based optogenetic device for pulsatile transgene expression enabling glucose homeostasis in mice. Nat Commun. 2021 Jan 27.(IF:14.92)華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院楊弋團隊

      [14] Pan Y, He X, et al. Neuronal activity recruits the CRTC1/CREB axis to drive transcription-dependent autophagy for maintaining late-phase LTD. Cell Rep. 2021 Jul 20.(IF:9.420)浙江大學(xué)腦科學(xué)與腦醫(yī)學(xué)學(xué)院馬歡團隊

      [15] Liu H, Xing R, et al. G-protein-coupled receptor GPR17 inhibits glioma development by increasing polycomb repressive complex 1-mediated ROS production. Cell Death Dis. 2021 Jun 12.(IF:8.463)廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳穎團隊

      [16] Yan F, Huang C, et al. Threonine ADP-Ribosylation of Ubiquitin by a Bacterial Effector Family Blocks Host Ubiquitination. Mol Cell. 2020 May 21.(IF:17.97)浙江大學(xué)生命科學(xué)研究院朱永群團隊

      [17] Luo Q, Wu X, et al. TRIM32/USP11 Balances ARID1A Stability and the Oncogenic/Tumor-Suppressive Status of Squamous Cell Carcinoma. Cell Rep. 2020 Jan 7.(IF:9.42)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室劉芝華團隊

      [18] Sun X, Peng X, et al. ADNP promotes neural differentiation by modulating Wnt/β-catenin signaling. Nat Commun. 2020 Jun 12.(IF:14.911)中國科學(xué)院水生生物研究所孫玉華團隊

      [19] Yang X, Wang H, et al. Rewiring ERBB3 and ERK signaling confers resistance to FGFR1 inhibition in gastrointestinal cancer harbored an ERBB3-E928G mutation. Protein Cell. 2020 Dec.(IF:14.872)浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院/轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院閔軍霞團隊

      [20] Zou Y, Wang A, et al. Analysis of redox landscapes and dynamics in living cells and in vivo using genetically encoded fluorescent sensors. Nat Protoc. 2018 Oct.(IF:13.490)華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院楊弋、趙玉政團隊

      [21] Zhang K, Zhao X, et al. Enhanced Therapeutic Effects of Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes with an Injectable Hydrogel for Hindlimb Ischemia Treatment. ACS Appl Mater Interfaces. 2018 Sep 12.(IF:8.09)南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院李宗金團隊

      [22] Hao H, Hu S, et al. Loss of Endothelial CXCR7 Impairs Vascular Homeostasis and Cardiac Remodeling After Myocardial Infarction: Implications for Cardiovascular Drug Discovery. Circulation. 2017 Mar 28.(IF:29.69)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院阜外醫(yī)院王淼團隊

       
       
      科研路上會遇到各種磕磕絆絆,小翌助您過關(guān)斬將,每天都出好數(shù)據(jù)。
       

      翌圣生物轉(zhuǎn)染試劑產(chǎn)品

      應(yīng)用場景

      名稱

      貨號

      規(guī)格

      細(xì)胞類型:貼壁/懸浮

      核酸類型:DNA、siRNA

      Hieff Trans® 脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑

      40802ES02

      0.5 mL

      40802ES03

      1.0 mL

      40802ES08

      5×1 mL

      細(xì)胞類型:貼壁/懸浮
      核酸類型:DNA

      磷酸鈣法細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑

      40803ES70

      200 T

      用途:病毒感染、DNA轉(zhuǎn)染

      聚凝胺(10 mg/ml

      40804ES76

      500 μL

      40804ES86

      5×500 μL

      細(xì)胞類型:懸浮
      核酸類型:DNA、siRNA

      Hieff Trans® 懸浮細(xì)胞專用脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑

      40805ES02

      0.5 mL

      40805ES03

      1.0 mL

      40805ES08

      5×1 mL

      細(xì)胞類型:貼壁/懸浮
      核酸類型:siRNA、miRNA

      Hieff Trans® siRNA/miRNA體外轉(zhuǎn)染試劑

      40806ES01

      0.1 mL

      40806ES02

      0.5 mL

      40806ES03

      1.0 mL

      細(xì)胞類型:貼壁/懸浮
      核酸類型:DNAsiRNA、miRNA

      Hieff Trans® 通用型轉(zhuǎn)染試劑

      40808ES02

      0.5 mL

      40808ES03

      1 mL

      40808ES08

      5×1 mL

      細(xì)胞類型:貼壁/懸浮
      核酸類型:mRNA

      Hieff Trans® mRNA轉(zhuǎn)染試劑

      40809ES01

      0.1 mL

      40809ES03

      1 mL

      細(xì)胞類型:貼壁/懸浮
      核酸類型:DNA

      PEI轉(zhuǎn)染試劑MW25000

      40815ES03

      1 g

      40815ES08

      5×1 g

      細(xì)胞類型:貼壁/懸浮
      核酸類型:DNA

      線性PEI轉(zhuǎn)染試劑(速溶型)MW40000

      40816ES02

      100 mg

      40816ES03

      1 g

      細(xì)胞類型:293
      核酸類型:DNA
      用途:AAV/LV載體研發(fā)與工藝開發(fā)

      Hieff Trans® PEI轉(zhuǎn)染試劑

      40820ES04

      1.5 mL

      40820ES10

      10 mL

      40820ES60

      100 mL

      細(xì)胞類型:293

      核酸類型:DNA

      用途:AAV/LV載體大規(guī)模生產(chǎn)

      Hieff Trans® PEI Transfection Reagent-GMP

      40821ES10

      10 mL

      40821ES60

      100 mL

      40821ES80

      1 L

      點擊產(chǎn)品名稱了解詳情

      400-6111-883