產(chǎn)品描述

Hieff NGS^® MaxUp^TM II Dual-model mRNA Library Prep Kit for Illumina^®是針對Illumina^®高通量測序平臺專門研發(fā)的用于mRNA轉(zhuǎn)錄組文庫構建試劑盒，本試劑盒將cDNA二鏈合成與Endprep、dA-tailing進行合并，極大地縮減建庫時間。二鏈合成模塊配有兩種buffer，客戶可根據(jù)需要進行常規(guī)建庫或鏈特異性建庫。本產(chǎn)品適用于起始模板為0.1-4 μg不同來源真核生物總RNA樣本。經(jīng)過mRNA分離、片段化、雙鏈cDNA合成、末端修復、加A尾、接頭連接和文庫擴增，總RNA樣品最終轉(zhuǎn)化為適用于Illumina^®平臺測序的文庫。

試劑盒包含兩個獨立模塊，BOX-I的核心為純化mRNA所需的oligo(dT)磁珠。BOX-II包含mRNA片段化試劑，反轉(zhuǎn)錄試劑，常規(guī)和鏈特異性dscDNA合成，以及后續(xù)建庫所需的所有試劑。其中鏈特異性二鏈合成buffer中將dTTP替換為dUTP，使cDNA第二鏈中摻入dUTP，而本試劑盒使用的高保真DNA聚合酶無法擴增含尿嘧啶的DNA模板，實現(xiàn)鏈特異性。提供的所有試劑都經(jīng)過嚴格的質(zhì)量控制和功能驗證，最大程度上保證了文庫構建的穩(wěn)定性和重復性。

產(chǎn)品組分

組分編號和名稱				12300ES08	12300ES24	12300ES96
BOX-I	12603-A		mRNA Capture Beads	0.4 mL	1.2 mL	4.8 mL
	12603-B		Beads Binding Buffer	0.4 mL	1.2 mL	4.8 mL
	12603-C		Beads Wash Buffer	5 mL	15 mL	60 mL
	12603-D		Tris Buffer	0.4 mL	1.2 mL	4.8 mL
BOX-II	12251-A		Frag/Prime Buffer	150 μL	450 μL	2×900 μL
	12251-B		1st Strand Enzyme Mix	16 μL	48 μL	192 μL
	12251-C		Strand Specificity Reagent	50 μL	150 μL	580 μL
	12251-D		2nd Strand Buffer (dNTP)	240 μL	720 μL	2×1440 μL
	12251-E		2nd Strand Buffer (dUTP)	240 μL	720 μL	2×1440 μL
	12251-F		2nd Strand Enzyme Master Mix	40 μL	120 μL	480 μL
	12251-G		Ligation Enhancer	240 μL	720 μL	2×1440 μL
	12251-H		Quick T4 DNA Ligase	40 μL	120 μL	480 μL
	12251-I		2×Super Canace® II High-Fidelity Mix	200 μL	600 μL	2×1200 μL
	12251-J		Primer Mix	40 μL	120 μL	480 μL

運輸與保存方法
 

冰袋運輸。效期一年。存儲溫度如下，切不可搞錯！

Box I：2-8℃保存；Box II：-20℃保存。

注意事項

一、 關于操作

1.為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2.請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。

3.推薦在帶熱蓋的PCR儀中進行各步驟反應，使用前應預熱PCR儀至反應溫度附近。

4.請使用無RNase污染的耗材，并對實驗區(qū)域定期進行清理，推薦使用ThermoFisher公司的RNAZap^TM高效核酸去除噴霧去除RNA酶污染。

5.PCR產(chǎn)物因操作不當極容易產(chǎn)生氣溶膠污染，進而影響實驗結(jié)果準確性。推薦將PCR反應體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測區(qū)進行強制性的物理隔離；配備文庫構建專用移液器等設備；定時對各實驗區(qū)域進行清潔（推薦使用ThermoFisher公司的DNAZap^TM高效核酸去除噴霧），以保證實驗環(huán)境的潔凈度。

二、應用范圍

本試劑盒適用于起始模板量為0.1-4 μg（體積≤50 μL）的高質(zhì)量動物、植物和真菌等真核生物的總RNA。如初始RNA濃度偏低，體積超過50 μL，可使用Hieff NGS^® RNA Cleaner磁珠進行濃縮。RNA需通過Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico芯片檢測，RIN值要求＞7，以保證mRNA有完整的poly(A)尾結(jié)構。

本試劑盒的mRNA分離模塊使用的是oligo (dT)磁珠，只有帶poly(A)尾的mRNA才能被提取；其他不具poly(A)尾的RNA，如非編碼RNA、無poly(A)尾的mRNA等不能適用本試劑盒。此外，F(xiàn)FPE樣本中的mRNA降解嚴重，通常無完整的poly(A)尾結(jié)構，故亦無法使用本試劑盒進行建庫。

本試劑盒所制備文庫可進行多種RNA-Seq應用，包括：

基因表達（gene expression）

單核苷酸變異檢測（single nucleotide variation discovery）

基因融合鑒定（gene fusion identification）

剪切變異體分析（splice variant analysis）

三、關于接頭連接（Adapter Ligation）

1.本公司可提供長接頭（barcoded Adapter）試劑盒和短接頭（也稱為小Y接頭、不完整接頭）試劑盒，客戶可根據(jù)實驗需求進行選擇。

目前有48種Indexed Adapters: Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®, Set 1~Set 4（Cat#12615~Cat#12618）；單端 96種 Index Primers: Hieff NGS^® 96 Single Index Primers Kit for Illumina^® , Set 1~Set 2 （Cat#12611~Cat#12612）；雙端 384 種 Index Primers: Hieff NGS^® 384 Dual Index Primers Kit for Illumina^® , Set 1~Set 2 （Cat#12613~Cat#12614）。

2.我們建議選用高質(zhì)量的商業(yè)化接頭，如客戶使用自制接頭，請委托具有NGS引物合成經(jīng)驗的公司，并備注需進行嚴格的防污染控制。此外，進行接頭退火操作時，請在超凈臺完成。每次只操作一種接頭，防止交叉污染。

3.使用接頭時，請?zhí)崆皩⒔宇^取出放在4°C或冰盒上解凍；在室溫操作時，實驗室溫度最好不要超過25°C，防止接頭解鏈。

4.建庫過程中，接頭濃度過高或過低都會導致建庫成功率變低。本試劑盒操作方案中，所加入的接頭體積固定為5 μL，請根據(jù)初始的RNA投入量，參考表1對接頭進行稀釋。接頭稀釋液請選擇0.1×TE buffer，稀釋過的接頭可在4°C保存48小時。

表1 Input Total RNA量與接頭濃度推薦表

四、關于磁珠純化與分選（Bead-based Clean Up and Size Selection）

1.建庫過程中有多個步驟需要使用DNA純化磁珠，我們推薦使用Hieff NGS^® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure^® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)進行DNA純化和分選。

2.磁珠使用前應先平衡至室溫，否則會導致得率下降、分選效果不佳。

3.磁珠每次使用前都應充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

4.轉(zhuǎn)移上清時，請勿吸取磁珠，即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫質(zhì)量。

5.磁珠洗滌使用的80%乙醇應現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。

6.產(chǎn)物洗脫前應將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇殘留影響后續(xù)反應；過分干燥又會導致磁珠開裂進而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥。

7.DNA純化或長度分選產(chǎn)物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脫，產(chǎn)物于4°C可保存2天，-20°C可保存1個月。

五、關于文庫擴增（Library Amplification）

1.本試劑盒中的文庫擴增組分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所組成，在第一代的基礎上，大大增強了擴增的均一性，即使是低拷貝的基因，也能進行無偏好性地擴增。

2.如果您使用Indexed Adapter（也稱為長接頭、大Y接頭），可使用本試劑盒提供的引物Primer mix進行擴增；如果使用的是“短接頭”或者叫“小Y接頭”，則需要使用index primers進行擴增，加上相應的barcodes。

3.文庫擴增步驟需要嚴格控制擴增循環(huán)數(shù)。循環(huán)數(shù)不足，將導致文庫產(chǎn)量低；循環(huán)數(shù)過多，又將導致文庫偏好性增加、重復度增加、嵌合產(chǎn)物增加、擴增突變積累等多種不良后果。表2列舉了使用本試劑盒進行文庫擴增，Input Total RNA量與相應擴增循環(huán)數(shù)的推薦。

表2 Input Total RNA量與擴增循環(huán)數(shù)推薦表*

【注】：*由于不同物種和組織所提取的Total RNA中，mRNA的含量差異較大。實驗中需根據(jù)建庫起始量、物種類型及樣本處理情況適當調(diào)整擴增循環(huán)數(shù)。

六、關于文庫質(zhì)檢（Library Quality Analysis）

1.通常情況下，構建好的文庫可通過長度分布檢測和濃度檢測來進行質(zhì)量評價。

2.文庫濃度檢測可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit^®、PicoGreen^®等；基于qPCR絕對定量的方法。

3.推薦使用qPCR方法進行文庫濃度檢測：Qubit^®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測定方法時，無法有效區(qū)分單端連接Adapter的產(chǎn)物、兩端均未連接Adapter的產(chǎn)物及其他不完整雙鏈結(jié)構產(chǎn)物；qPCR絕對定量基于PCR擴增原理，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫（即可測序的文庫），可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測序文庫的干擾。

4.文庫濃度檢測不可使用：基于光譜檢測的方法，如NanoDrop^®等。

5.文庫長度分布檢測，可通過Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細管電泳或微控流原理的設備進行檢測。

使用方法

一、自備材料

1.純化磁珠：Hieff NGS^® DNA Selection Beads（Cat#12601）或AMPure XP Beads（Cat#A63880）或其他等效產(chǎn)品。

2.RNA質(zhì)控：Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip或其他等效產(chǎn)品。

3.Adapters：barcoded adapter（長接頭）或者無barcode的短接頭試劑盒。

4.文庫質(zhì)檢：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效產(chǎn)品；文庫定量試劑。

5.其他材料：無水乙醇、無菌超純水、低吸附槍頭、PCR管、磁力架、PCR儀等。

二、操作流程 

圖1 mRNA建庫試劑盒操作流程

三、操作步驟

3.1 mRNA純化和片段化（mRNA Purification and Fragmentation）

1.將mRNA Capture Beads從2-8℃取出，靜置使其溫度平衡至室溫，約30 min。

2.準備一個Nuclease free離心管，取0.1-4 μg總RNA，用Nuclease free水將體積補至50 μL，冰上放置備用。

3.顛倒或旋渦振蕩混勻磁珠，吸取50 μL磁珠懸液加入至50 μL總RNA樣品中，用移液器吹打6次，使其充分混勻。

4.將磁珠與RNA的混合物置于PCR儀中，65℃，5 min；4℃，hold，使得RNA變性。

5.室溫孵育5 min，使mRNA與磁珠完全結(jié)合。

6.將樣品置于磁力架中，室溫靜置5 min，使mRNA與總RNA分離，小心移除上清。

7.將樣品從磁力架上取出，用200 μL Beads Wash Buffer重懸磁珠，移液器反復吹打6次以徹底混勻。將樣品置于磁力架中，室溫靜置5 min，小心移除上清。

8.重復步驟7，共洗滌兩次。

9.將樣品從磁力架上取出，加入50 μL Tris Buffer重懸磁珠，用移液器反復吹打6次以徹底混勻。

10.將樣品置于PCR儀中，80℃，2 min；25℃，hold，將mRNA洗脫下來。

11.將樣品從PCR儀中取出，加入50 μL Beads Binding Buffer，用移液器反復吹打6次以徹底混勻。

12.室溫放置5 min，使mRNA結(jié)合到磁珠上。

13.將樣品置于磁力架中，室溫靜置5 min，小心移除上清。

14.將樣品從磁力架上取出，用200 μL Beads Wash Buffer重懸磁珠，移液器反復吹打6次以徹底混勻，將樣品重新放回

至磁力架中，室溫靜置5 min，吸掉全部上清。

【注】：最后需要用10 μL移液器吸干凈殘留液體。

15.將樣品從磁力架上取出，用18.5 μL Frag/Prime buffer重懸磁珠，用移液器吹打6次以徹底混勻；將樣品置于PCR儀中（預設為94℃或85℃），可參考表3選擇片段化程序，但不同物種片段化的效果有差異，客戶可先根據(jù)自己的情況，做個片段化時間的梯度，比如94℃，5 min或85℃，6 min。使用Agilent 2100分析雙鏈cDNA純化產(chǎn)物大小。

表3 mRNA片段化程序選擇

16. 片段化程序結(jié)束后，為防止poly(A)尾RNA與磁珠結(jié)合，請立即將樣品置于磁力架中，待溶液澄清后，轉(zhuǎn)移17 μL上清至一個新的nuclease free離心管中，立刻進入第一鏈合成反應。

3.2 第一鏈cDNA的合成：

1. 將第一鏈合成試劑從-20°C取出，顛倒混勻后瞬離。按表4所示，配制第一鏈cDNA合成的反應液。

表4 第一鏈cDNA合成反應體系

2. 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應液離心至管底。

3. 將上述PCR管置于PCR儀中，按照表5所示設置反應程序，進行第一鏈cDNA的合成。反應結(jié)束后立即進行第二鏈cDNA的合成。

表5 第一鏈cDNA合成反應程序

3.3第二鏈cDNA的合成/末端修復/加A：

1. 將第二鏈合成試劑從-20 °C取出，解凍后顛倒混勻；按照表6所示，配制第二鏈cDNA合成/末端修復/加A反應液。

表6 第二鏈cDNA合成反應體系

【注】：*如構建普通mRNA文庫，請使用含dNTP的buffer；如構建鏈特異性mRNA文庫，請使用含dUTP的buffer。

2.使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應液離心至管底。

3. 將上述PCR管置于PCR儀中，按照表7所示設置反應程序，進行第二鏈cDNA的合成。

表7 第二鏈cDNA合成反應程序

3.4 接頭連接（Adapter Ligation）

該步驟可在末端修復和dA尾添加的產(chǎn)物末端，連接特定的Illumina^®接頭。

1. 參考注意事項三中的表1，根據(jù)Input RNA量，稀釋Adapter至合適濃度。

2. 將表8中各試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

3. 于3.3步驟結(jié)束后的PCR管中繼續(xù)配制表8所示反應體系。

表8 Adapter Ligation體系

【注】：*Ligation Enhancer使用前請上下顛倒、振蕩，充分混勻并瞬時離心后使用。

**本公司接頭原始濃度為15 μM, 請根據(jù)注意事項三表1的提示，用0.1×TE buffer對接頭進行稀釋，使接頭添加體積固定為5 μL。

4. 使用移液器輕輕吹打混勻，并短暫離心將反應液收集至管底。

5. 將PCR管置于PCR儀中，設置表9所示反應程序，進行接頭連接反應：

表9 Adapter Ligation反應程序

【注】：當Input DNA量較低時，可嘗試將連接時間延長一倍，這將提高連接效率。

3.5 連接產(chǎn)物純化和片段大小分選（Post Ligation Clean Up and Size Selection）

目前有兩個方案應用于該步驟，當插入片段＜200 bp時，使用方案A；當插入片段≥200 bp時，使用方案B。

方案A：適用于插入片段150-200 bp的文庫（如mRNA打斷方案為94°C，6 min）

1. 準備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取60 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.6×，Beads:DNA=0.6:1）至Adapter Ligation產(chǎn)物中，渦旋或吹打混勻，室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重復步驟5，總計漂洗兩次。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過5 min）。

8. 將PCR管從磁力架中取出，加入21 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約5 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，進行PCR擴增。

方案B：適用于插入片段大于200 bp的文庫（如mRNA打斷方案為94°C，5 min或85℃，8 min）

方案B-1：接頭連接產(chǎn)物的純化

1. 準備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取60 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.6×，Beads:DNA=0.6:1）至Adapter Ligation產(chǎn)物中，渦旋或吹打混勻，室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重復步驟5，總計漂洗兩次。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過5 min）。

8. 將PCR管從磁力架中取出，加入102 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約5 min），小心移取100 μL上清至新PCR管中，準備進行雙輪分選。

【注】：Ligation Enhancer中含有的高濃度PEG會對磁珠雙輪分選產(chǎn)生影響，所以必須經(jīng)過一輪純化后再進行雙輪分選。

方案B-2：雙輪分選

1. 請渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證混勻。

2. 根據(jù)DNA片段長度要求，參考表10，在上述100 μL DNA中加入第一輪分選磁珠，渦旋或移液器吹打10次混勻。

表10文庫分選推薦磁珠比例

【注】：此表推薦的雙輪分選比例適用于AMPure^® XP磁珠和Hieff NGS^® DNA Selection Beads；表中“×”表示樣品DNA體積。如所需文庫插入片段主峰為300 bp時，若在短接頭連接之后分選，樣品DNA體積為100 μL，則第一輪分選磁珠使用體積為0.65×100 μL=65 μL，第二輪分選磁珠使用體積為0.15×100 μL=15 μL；若在長接頭連接之后分選，樣品DNA體積為100 μL，則第一輪分選磁珠使用體積為0.62×100 μL=62 μL，第二輪分選磁珠使用體積為0.15×100 μL=15 μL。

3. 室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移上清到干凈的離心管中，殘留1-2 μL溶液于管底。

5. 參考表10向上清中加入第二輪分選磁珠。

6. 渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫靜置5 min。

7. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

8. 保持PCR管始終處于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec，小心移除上清。

9. 重復步驟8。

10. 保持PCR管始終處于磁力架中，開蓋干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（約5 min）。

11. 將PCR管從磁力架中取出，加入21 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻，室溫靜置5 min。

12. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移20 μL上清至干凈管中。

3.6文庫擴增（Library Amplification）

該步驟將對純化或長度分選后的接頭連接產(chǎn)物進行PCR擴增富集。

1. 將表11中的試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于無菌PCR管中配制表11所示反應體系。

表11-A  短接頭連接產(chǎn)物PCR反應體系

表11-B  長接頭連接產(chǎn)物PCR反應體系

【注】：*如果使用的是無barcode的接頭，俗稱短接頭（小Y接頭），請使用短接頭試劑中配備的index primer進行擴增（Cat#12611，Hieff NGS^® 96 Single Index Primers Kit for Illumina^®, Set 1; Cat#12612, Hieff NGS^® 96 Single Index Primers Kit for Illumina^®, Set 2。Cat#12613, Hieff NGS^® 384 Dual Index Primers Kit for Illumina^® , Set 1; Cat#12614，Hieff NGS^® 384 Dual Index Primers Kit for Illumina^® , Set 2。）

**如果您使用的是barcoded adapter，俗稱長接頭（大Y接頭），即adapter上帶有barcode的完整接頭，可用試劑盒中的Primer Mix進行擴增； 

3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應液收集至管底。

4. 將PCR管置于PCR儀中，設置表12示反應程序，進行PCR擴增。

表12  PCR擴增反應程序

3.7 擴增產(chǎn)物磁珠純化或分選（Post Amplification Clean Up/Size Selection）

同3.5步驟中純化操作步驟。使用Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）純化文庫擴增產(chǎn)物。

3.8 文庫質(zhì)量控制

通常情況下，構建好的文庫可通過濃度檢測和長度分布檢測來進行質(zhì)量評價，具體請參見注意事項六。

附錄一：mRNA片段化

圖2. mRNA不同打斷時間對應的雙鏈cDNA片段范圍。取1 μg Universal Human Reference RNA，經(jīng)mRNA提取試劑盒提取后，分別以94°C，6 min、85℃，8 min和85℃，5 min處理。打斷后mRNA進行雙連cDNA的合成，經(jīng)過1.8×磁珠回收后，通過Agilent 2100 Bioanalyzer進行檢測。

【注】：本結(jié)果使用的RNA是Agilent公司的Universal Human Reference RNA，若使用其他來源的RNA，最好優(yōu)化打斷時間。