細胞增殖檢測是評估細胞健康程度、遺傳毒性及抗腫瘤藥物效果的基礎實驗手段。常用的檢測細胞增殖方法是BrdU法。EdU法檢測是Brdu方法的升級和突破。EdU（5-溴-2-脫氧尿嘧啶）是一種嘧啶類似物，可在DNA合成期整合入DNA雙鏈。EdU法檢測是基于“點擊”反應，一種由銅催化的疊氮化合物和炔烴的原子共價反應。

試劑盒中EdU試劑含有炔烴，而Yefluor 594 Azide染料試劑含有疊氮化合物。點擊法的EdU標記增殖快速有效，易于使用。只需少量的疊氮化染料即可有效地標記出整合的EdU。標準化的戊二醛固定和去污劑促滲可以使檢測試劑進入細胞，而Brdu方法則需要DNA變性（如酸變性、熱變性或者用DNase消化）去暴露BrdU從而方便BrdU抗體結合。

本試劑盒包含EdU法檢測所需要的所有組份，可以檢測細胞增殖與細胞周期分析，適用于熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測。對于細胞周期的分析，試劑盒提供了細胞核染料Hoechst 33342。

 

產(chǎn)品信息

貨號	40276ES60 / 40276ES76
規(guī)格	100 T / 500 T（適用于熒光顯微鏡）；或10 T / 50 T（適用于流式細胞儀）
光譜特性	Yefluor 594 Azide：Ex/Em=594/617 nm；Hoechst 33342：Ex/Em=350/461nm, bound to DNA
適用設備	熒光顯微鏡；流式細胞儀

 

組分信息

組分編碼	組分名稱	40276ES60 (100 T / 10 T)	40276ES76 (500 T / 50 T)
40276-A	10 mM EdU	0.2 mL	1 mL
40276-B	Yefluor 594 Azide	50 µL	250 µL
40276-C	10× Click-iT EdU反應緩沖液	1 mL	5 mL
40276-D	CuSO4	0.5 mL	2×1.25 mL
40276-E	Click-iT EdU緩沖液添加物	30 mg	150 mg
40276-F	Hoechst 33342	25 µL	125 µL

 

儲存條件

-25~-15℃避光儲存，有效期1年。開封后，組分A（10 mM EdU）需-25~-15℃儲存，組分B（Yefluor 594 Azide）需-25 ~-15℃避光儲存，其余組分2-8 ℃存儲即可。

 

使用說明

熒光顯微鏡檢測方法

1.其他所需試劑

10 mM PBS, pH 7.2-7.6

中性多聚甲醛固定液（4%多聚甲醛 in PBS ）

2 mg/ml 甘氨酸溶液（去離子水配制）

促滲試劑（0.5% Triton X-100 in PBS）

3% BSA in PBS, pH 7.2-7.6

去離子水

18×18 mm 蓋玻片

2. EdU標記細胞

注意：EdU的標記濃度應根據(jù)所用的細胞類型做相應的優(yōu)化選擇，推薦客戶以10 μM的EdU初始濃度進行摸索。細胞培養(yǎng)基、細胞生長密度及細胞類型和其他實驗條件都有可能影響細胞的標記效果。預實驗中我們建議客戶設置一系列的EdU濃度梯度，以確定最佳的合適您的細胞的實驗濃度。

1）以每孔4×10³-1×10⁵細胞接種于96孔板中，進行您所需要的藥物處理或者其他刺激處理。

2）準備一份2×的EdU工作液（組分A）：以完全培養(yǎng)基稀釋10 mM的儲液至合適的工作濃度。建議您以10 μM的初始工作濃度開始預實驗。

3）預熱2×的EdU工作液，加入等體積的培養(yǎng)基，使?jié)舛茸優(yōu)?×(如：需要得到10 μM的終濃度，應以新鮮培養(yǎng)基等體積加入到20 μM的EdU工作液中)。

4）合適時間合適條件孵育細胞，EdU孵育細胞的時間可以直接用作測定細胞DNA合成的指標，時間點選擇以及孵育時間的長度取決于細胞生長速率。通過短暫的EdU孵育進行的脈沖式標記細胞可以用于研究細胞周期動力學。

3. 細胞固定及促滲操作

1）孵育完成后，去除培養(yǎng)基加入50 μL 4%中性多聚甲醛至各個孔，室溫孵育15-30 min后，去除固定液。

2）每孔加入50 μL 2 mg/mL甘氨酸溶液，室溫孵育5 min，中和殘留的固定液。

3）以每孔0.1 mL 3% BSA in PBS的洗滌液洗滌細胞2次。

4）去除洗滌液，加入0.1 mL 0.5% Triton X-100 in PBS到每個孔中，室溫孵育20 min。

注意：本參考步驟是針對以4%中性多聚甲醛固定且以0.5% Triton X-100促滲操作樣本而優(yōu)化的操作方法，但本參考所介紹的步驟同樣可用于其他類似操作的樣本，如以甲醇固定以皂苷固定的樣本等。

4. EdU檢測

注意：本參考步驟每孔反應使用100μL的Click-iT反應混合物。用戶可根據(jù)自己的樣本情況調(diào)整等比例減少所用的溶液體積。

1）準備1× Click-iT EdU反應緩沖液（組分C）：10×組分C試劑以去離子水稀釋10倍即可。

2）制備一份5×的Click-iT EdU反應添加物儲液（組分E）：加0.3 mL去離子水至30 mg的E組分試管中（100 mg/mL），混勻至全部溶解。使用后，剩余儲液存放在≤-20℃，可保存一年，溶液一旦呈現(xiàn)棕色，則說明有效成分降解不能再用（注意：不同規(guī)格的組分E均按照此比例加去離子水溶解為5×儲液備用）。

3）準備1× Click-iT EdU緩沖液添加物：以去離子水稀釋5×儲液（組分E）至1×，溶液應新鮮配置，當天用完。

4）依據(jù)表1準備Click-iT反應混合物。表1要求添加的組分對于反應來說非常重要，否則反應無法有效進行。

表1.用于熒光顯微鏡檢測的Click-iT反應混合物

組分名稱	以10個孔的樣本數(shù)為例
1× Click-iT EdU反應緩沖液（組分C）	855 µL
CuSO4 （組分D）	40 µL
Yefluor 594 Azide（組分B）	5 µL
1×反應緩沖液添加物（步驟4.3所準備）	100 µL
總體積	1 mL

5）去除促滲劑，以每孔0.1 mL的3% BSA in PBS的洗滌液洗滌2次，去除洗滌液。

6）加入0.1 mL Click-iT反應混合物至每個孔，簡短搖晃培養(yǎng)板以確保反應混合物可以均勻覆蓋細胞。

7）室溫避光孵育30 min。

8）除去反應混合物，每孔以0.1 mL 3% BSA in PBS洗滌兩次，去除洗滌液。

對于核染色，可以進行DNA復染。如其他無特別要求，即可進行拍照分析。

5. DNA復染（可選）

1）以0.1 mL PBS洗滌每孔1次，去掉洗滌液。

2）以PBS稀釋Hoechst 33342（組分F）儲液1:2000至1× Hoechst 33342溶液，終濃度為5 µg/mL。

3）每孔加0.1 mL 1× Hoechst 33342溶液，室溫避光孵育15-30 min。除去Hoechst 33342溶液。

4）0.1 mL PBS洗滌每孔2次，去除洗滌液。

流式細胞儀檢測方法

6.其他所需試劑

10 mM PBS, pH 7.2-7.6

中性多聚甲醛固定液（4%多聚甲醛in PBS ）

促滲試劑（0.5% Triton X-100 in PBS）

1% BSA in PBS, pH 7.4

7.EdU標記

注意：EdU的標記濃度應根據(jù)所用的細胞類型做相應的優(yōu)化選擇，推薦客戶以10 µM的EdU初始濃度進行摸索。細胞培養(yǎng)基、細胞生長密度及細胞類型和其他實驗條件都有可能影響細胞的標記效果。預實驗中，我們建議客戶設置一系列的EdU濃度梯度，以確定最佳的合適您的細胞的實驗濃度。

1）按每孔1×10⁵~3×10⁶個細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)至正常生長階段。進行您所需要的藥物處理或者其他刺激處理。

2）EdU加入細胞培養(yǎng)基至所需的濃度混勻，推薦客戶以10 μM的EdU初始濃度進行摸索。細胞培養(yǎng)基、細胞生長密度及細胞類型和其他實驗條件都有可能影響細胞的標記效果。

3）以合適時間和條件孵育細胞，EdU孵育細胞的時間可以直接用作測定細胞DNA合成的指標，時間點選擇以及孵育時間的長度取決于細胞生長速率。通過短暫的EdU孵育進行的脈沖式標記細胞可以用于研究細胞周期動力學。

注意：EdU濃度與孵育時間相關，短時間孵育(< 2 h)宜采用高濃度，如：10~50 μM，長時間孵育( >24 h)宜采用低濃度，如：1~10 μM。

8. 細胞固定及促滲操作

1）孵育完成后，收集細胞，1% BSA in PBS清洗細胞1次，離心收集細胞。

2）100 µL 4%多聚甲醛in PBS重懸細胞。

3）室溫避光孵育15 min。

4）1% BSA in PBS的洗滌液洗滌細胞2次。

5）0.1 mL 0.5% Triton X-100促滲液重懸細胞，室溫孵育20 min。

注意: ①本參考步驟是針對以4%中性多聚甲醛固定且以0.5% Triton X-100促滲操作樣本而優(yōu)化的操作方法，但本參考所介紹的步驟同樣可用于其他類似操作的樣本，如以甲醇固定以皂苷固定的樣本等等。

②對于需要同時做細胞表面抗原標記的實驗，可以考慮在完成EdU孵育后，以含1% BSA-PBS洗滌2次細胞后，在細胞固定促滲之前進行。

9. EdU檢測

1）制備一份5×的Click-iT EdU反應添加物儲液（組分E）：加1 mL去離子水至100 mg的E組分試管中（100 mg/mL），混勻至全部溶解。使用后，剩余儲液存放在≤ -20 ℃，可保存一年，溶液一旦呈現(xiàn)棕色，則說明有效成分降解不能再用（注意：不同規(guī)格的組分E均按照此比例加去離子水溶解為5×儲液備用）。

2）準備1× Click-iT EdU緩沖液添加物：以去離子水稀釋5×儲液（組分E）至1×，溶液應現(xiàn)用現(xiàn)配，當天用完。

3）準備1× Click-iT EdU反應緩沖液: 10×Click-iT EdU反應緩沖液 (組分C) 以去離子水稀釋10倍即可。

4）依據(jù)表2準備Click-iT反應混合物。

注意：表2要求添加的組分對于反應來說非常重要，否則反應無法有效進行。

表2. 用于流式細胞儀檢測的Click-iT反應混合物

組分名稱	每單次反應所需的加液體積
1× Click-iT EdU反應緩沖液（步驟9.3所準備）	875 µL
CuSO4 （組分D）	20 µL
Yefluor 594 Azide（組分B）	5µL
1×反應緩沖液添加物（步驟9.2所準備）	100 µL
總體積	1 mL

5）加入1 mL Click-iT反應混合物至每管，混勻。

6）室溫避光孵育反應混合物30 min。

7）以1% BSA in PBS洗滌細胞一次，收集細胞去除上清，以1 mL含1% BSA的PBS重懸細胞，上機檢測。

 

注意事項

1.為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2.本產(chǎn)品僅作科研用途！

 

Ver.CN20230525