1963年J.B.S.Haldane在題為“人類種族在未來二萬年的生物可能性”的演講上采用“克?。–lone）”的術語，把“克隆技術”帶到了人們的視野中，其本身的含義是無性繁殖。

克隆技術又稱為“生物放大技術”，它經歷了三個發(fā)展時期：

目前應用最廣泛的技術為“分子克隆”，又稱重組DNA技術，是將目的DNA片段按照人們的設計定向連接起來，在特定的受體細胞中與載體同時復制并得到表達，產生新的遺傳性狀。

傳統分子克隆實驗流程如下圖：

圖1.傳統分子克隆實驗流程

傳統分子克隆載體制備的第一步是通過限制性酶切構建插入位點。限制性內切酶的選擇取決于載體和插入片段上是否存在相應的識別序列、識別序列的位置以及是否適于連接。MCS往往是插入片段的首選，因為該區(qū)域專用于克隆。

翌圣的FuniCut™快速限制性內切酶能快速、精準完成DNA切割。載體酶切后，為防止自連，可能有必要進行載體的去磷酸化，尤其當載體酶切后末端可互補或是平端時。載體的去磷酸化對于降低背景、促進所需片段插入載體非常重要。

圖2.FuniCut™快速限制性內切酶

（Cat#15001ES-15051ES）

克隆的插入片段來源可能為基因組DNA、另一質粒的一部分或者線性DNA片段。制備插入片段時常用的步驟是選擇適于將插入片段克隆進載體的限制性內切酶，進行限制性酶切，產生匹配的粘性末端，以便接下來將片段插入在載體中。對插入片段和載體進行雙酶切，以實現定向克隆。

插入片段和載體經酶切后，可在瓊脂糖凝膠上進行電泳并切割出目標片段，純化所需的片段。使用翌圣的瓊脂糖凝膠回收試劑盒（Cat#19101ES）能保證實驗流程高效、結果可靠、得率高。

制備插入片段另一個方法是通過高保真PCR（翌圣高保真PCR Cat#10164ES）試劑擴增所需要的插入片段，可加入相應的酶切位點或同源重組片段，純化后進行連接。

獲得目標片段后，可以構建連接反應，連接插入片段和載體。常用的連接酶為T4 DNA連接酶、拓撲異構酶。T4 DNA連接酶可連接DNA末端的5’-磷酸基和3’-羥基。

拓撲異構酶是指通過切斷DNA的一條或兩條鏈中的磷酸二酯鍵，然后重新纏繞和封口來更正DNA連環(huán)數的酶，需根據DNA片段的末端為粘性末端或者平末端來選擇不同的TOPO克隆試劑盒，如翌圣TOPO克隆系列—TA/Blunt（Cat#10907-10910）。

圖3.Hieff Clone^® Zero TOPO-Blunt Cloning Kit（Cat#10907）可有效克隆1-5 kb基因，成功率100%。

注：A-C：TOPO克隆轉化平板；D-F：插入片段PCR鑒定電泳圖。

不經過酶切的片段可使用同源重組酶連接到線性載體上。首先將載體線性化，并在插入片段正、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產物5’和3’末端分別帶有與線性化載體兩末端對應的完全一致的序列。PCR產物和線性化載體在重組酶的作用下，經過一定的時間和溫度即可進行轉化，完成定向克隆。

同源重組酶可連接單片段或者多片段，根據插入片段數的不同，選擇不同的一步法快速克隆試劑盒，如翌圣的Hieff Clone^® Plus One Step Cloning Kit一步法快速克隆試劑盒（Cat#10911ES）、Hieff Clone^® Universal One Step Cloning Kit通用型一步法快速克隆試劑盒（Cat#10922ES）。

圖4.同源重組原理

圖5.Hieff Clone^® Plus One Step Cloning Kit（Cat#10911ES）試劑盒可以有效克隆不同長度的單片段基因

注：載體：4.7 kb；插入片段：1.2 kb，3 kb和5 kb。

轉化是細菌細胞低頻率吸收外界DNA的自然過程。在分子生物學實驗中，用來在專門為吸收DNA而制備的“感受態(tài)”細菌內增殖質粒。可根據下游應用的不同，選擇不同的感受態(tài)細胞，常見的有DH5α化學感受態(tài)、TOP10化學感受態(tài)、BL21(DE3)化學感受態(tài)、根癌農桿菌感受態(tài)等。

市面上提供可實現高效、可靠轉染的感受態(tài)細胞。制備可進行轉化的“感受態(tài)”細菌的最常用方法是采用氯化鈣處理對數期細菌細胞。將化學感受態(tài)細胞和連接反應物混合，然后在42°C下熱激活，部分DNA會被細菌細胞吸收，并在細胞內開始復制。為了加快感受態(tài)轉化的流程，市面上也有應運而生的快速感受態(tài)，如翌圣F DH5α化學感受態(tài)（Cat#11803ES），10分鐘就能完成快速轉化。

圖6.感受態(tài)轉化流程

隨后，將轉化的細菌置于含有適量抗生素的瓊脂板上，通過藍白斑篩選或其它方法篩選含有所需質粒及插入片段的菌落。

轉化反應的菌液中，同時包含不帶載體的細胞、不含插入片段的載體、純插入片段、以及成功連接的載體和插入片段。為了獲得連接成功的載體和插入片段，可通過含有抗生素的平板進行篩選，不含載體的細菌缺少抗生素耐受性基因，因而不會生長。

但經轉化后含有載體的細菌，不論帶或不帶插入片段都能表達抗生素耐受性基因，因而可存活。為確定轉化的菌落是否含有插入片段，可采用多種方法，其中最常用的是藍白斑篩選法和陽性克隆篩選法。

藍白斑篩選法，將經轉化的細胞涂布到含有l(wèi)acZ轉錄誘導子、IPTG（Cat#10902ES）、X-gal（LacZ顯色底物，Cat#10901ES）的生長培養(yǎng)基上，LacZ會水解X-gal，產生藍色染料進而形成藍色菌落。當插入片段破壞了載體編碼的lacZα基因時，無法形成功能性LacZ，經轉化的菌落呈白色。

圖7.藍白斑篩選原理

陽性克隆篩選法，即在載體的MCS之中含有一個對于細菌宿主致命的基因。當插入片段成功連接到MCS內的致命基因內，可阻止其表達，從而確保只帶有插入片段載體的轉化細胞才能存活。

圖8.陽性克隆篩選原理

為了進一步驗證，還需要對從陽性菌落或白色菌落中提取的載體進行酶切，進行凝膠電泳，確定其條帶圖譜是否與所插入目的片段的條帶大小一致。還可通過菌落PCR法判斷DNA片段是否插入（翌圣快速PCR Cat#10157ES）；或通過測序確定插入片段基因是否突變等。

通過上述對“分子克隆技術”的介紹，相信大家已經充分認識到“分子克隆技術”在生物學研究領域是如基石一樣的存在，它的出現和應用開辟了分子遺傳學研究的新領域，作為生物技術界的頂流，它打開了人類了解、識別、分離和改造基因，創(chuàng)造新物種的大門。它的成就對于工業(yè)、農牧業(yè)和醫(yī)學產生深遠影響，并將為解決世界面臨的能源、食品和環(huán)保三大危機開拓一條新的出路。相信大家能通過這門技術，為世界探索真理、創(chuàng)造美好未來。